实验动物模型在生物学研究和生物医药开发中具有非常重要的作用，尤其是基因修饰小鼠在基因功能和信号通路等生物学基础研究方面做出了突出贡献；在人类疾病、个体发育以及再生治疗等研究中发挥了不可替代的作用。但是小鼠等啮齿类实验动物模型在器官大小、生理结构、发育周期、寿命等各方面与人类有很大差异，现已建立的小鼠疾病模型大多只能模拟人类疾病的部分症状，神经系统疾病、免疫系统疾病以及代谢类疾病小鼠模型其症状与人相差甚大，阻碍了对人类疾病的发病机制和治疗方法的研究。大动物模型在器官结构、大小以及生理代谢方面与人更加接近，其中由于猪具有饲养环境容易控制、繁殖周期短、繁殖能力强、遗传操作比较成熟、与灵长类动物相比无伦理问题等优点，普遍认为是比较理想的大动物疾病模型和异种器官移植模型。猪还是一种非常重要的农业经济动物，因此对其进行遗传改造，培育更加安全、具有优良品质、抗逆抗病以及高产的品系是当前研究的热点。迄今为止猪胚胎干细胞尚未成功建系，利用诱导多能干细胞技术制备的猪诱导多能干细胞并不具有生殖系嵌合能力，制备基因修饰猪主要依赖于体细胞基因修饰和体细胞核移植技术。目前，体细胞的基因修饰主要有宿主基因定点敲除和外源基因随机插入两种方法。人工核酸内切酶ZFN、TALEN和RNA介导的Cas9核酸酶的开发为基因敲除技术带来了革命性的的突破，解决了基因敲除难的问题。然而通过高表达外源基因制备具有特定性状的基因修饰猪在疾病模型及新品种培育中具有不可替代的作用。目前采用的随机转基因方法存在外源基因在基因组中的整合位点和拷贝数不可控、外源基因在猪体内表达不稳定，转基因猪个体之间表型差异等问题，严重制约了基因修饰猪的培育与应用。Rosa26是一个位于小鼠6号染色体上的非编码基因，最早由Friedrich和Soriano在研究小鼠胚胎干细胞基因突变时发现。对Rosa26进一步的研究显示该基因广泛表达于小鼠胚胎和成体所有的组织和细胞中。靶向修饰Rosa26被广泛应用于广谱性和条件性表达外源基因如报告基因（EGFP、lacZ、Luciferase）、位点特异性重组酶、转录因子以及非编码RNA。利用Rosa26位点已经建立了上百种基因敲入小鼠模型，广泛应用于基因功能、疾病机制、干细胞、再生治疗、RANi等研究领域。除小鼠外，ROSA26在大鼠和人胚胎干细胞也已被鉴定和靶向修饰，但尚未应用于大动物模型。因此在大动物模型中鉴定和靶向修饰ROSA26，将有效解决常规转基因修饰造成的诸多问题，为制备外源基因表达稳定、表型一致的模型提供有效的途径，必将极力推动基因修饰大动物模型的研究与应用。在本实验中，首先通过多重序列比对在小鼠、大鼠及人的ROSA26启动序列中找到一段保守序列，利用该序列做模板在猪的全基因组数据库中进行检索，在猪13号染色体上定位了一段同源性高达85%的序列，推测为猪的ROSA26（porcine ROSA26，pROSA26）。利用3’RACE、RT-PCR和qPCR技术检测到pROSA26在猪的各组织和细胞都有广泛表达。将pROSA26启动子序列克隆至红色荧光蛋白表达载体，在各种组织来源的细胞系中测试pROSA26启动子的活性，瞬时转染48h后，在所有细胞中都检测到了红色荧光蛋白的高表达。在此基础上，采用TALEN介导的基因打靶技术将一个Cre重组酶报告基因靶向插入到pROSA26基因位点，然后利用体细胞核移植技术成功获得了pROSA26基因打靶猪模型。该动物模型可用于猪发育过程中谱系示踪各类干细胞的分化和再生研究，为揭示人类干细胞相关的疾病机理和实施干细胞治疗提供的大动物实验依据。在该模型基础上，利用Cre重组酶启动报告基因EGFP表达，研究了pROSA26在体内启动外源基因表达的能力；同时将Cre基因敲入心肌特异性标记基因ISL1下游，使Cre重组酶在心肌细胞特异表达，在胚胎发育时期研究了ISL+心脏祖细胞的发育。在pROSA26位点引入一对异源loxP位点，利用RMCE（重组酶介导的基因交换）成功地将绿色荧光蛋白EGFP基因替换为红色荧光蛋白tdTomato基因，构建了重组酶介导的基因交换猪模型。利用该模型可以将任意基因通过RMCE靶向插入到pROSA26位点，实现目的基因在猪所有组织中的无差异表达。本实验首次在猪的基因组中定位了ROSA26位点，利用TALEN介导的基因打靶技术结合体细胞核移植技术建立了Cre介导的谱系追踪猪模型。在此基础上通过重组酶介导的基因交换可以将任何感兴趣的基因置于猪ROSA26位点，获得各组织无差异表达目的基因的基因修饰猪。本研究成功解决了常规随机转基因带来的诸多问题，克服了基因修饰动物携带抗性基因的安全隐患，对基因修饰猪的研究与在生物医药与农业中的应用产生巨大的推动作用。