洋茉莉醛是香精香料中重要的一员,在食品、化妆品以及医药等领域有重要的应用价值。洋茉莉醛主要是通过化学法合成得到,但存在反应繁琐、能耗高以及后期废液处理困难等问题。生物法合成具有反应条件温和、绿色环保等优势。本实验室开发了利用重组大肠杆菌全细胞合成洋茉莉醛的方法,本研究通过研究不同辅因子以及辅酶对反式茴香脑单加氧酶（TAO）酶活的影响,在大肠杆菌中共表达甲酸脱氢酶（FDH）与TAO,并优化其表达条件、以及全细胞催化条件,实现了洋茉莉醛的高效合成。具体实验内容如下:（1）TAO的克隆表达纯化、酶学分析及辅因子对酶活的影响:将tao基因分别克隆于质粒pET-28a、pETDuet-1、pET-20b和pGEX-6p-1中,在E.coli BL21（DE3）中进行诱导表达。发现E.coli BL21 DE（3）/pETDuet-1-tao的酶活和蛋白表达量较高,其粗酶液酶活为0.71 U·OD^-1。利用亲和层析的方法对E.coli BL21 DE（3）/pETDuet-1-tao粗酶液进行纯化,得到较单一目的蛋白。进行酶学分析得到:TAO最适反应温度和pH分别为30oC和8;以异黄樟油素为底物时,其K_m与K_cat分别为20.01 mmol·L^-1、1.45 s^-1。TAO酶活测定发现:添加辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和FDH可以明显提高反应速率,从而确定了催化反应的辅酶偶联策略。（2）优化TAO与FDH的共表达体系:选择来自于Candida boidinii的甲酸脱氢酶并进行密码子优化,在大肠杆菌中构建不同TAO与FDH共表达体系:E.coli BL21DE（3）/pETDuet-1-tao&pCDFDuet-1-fdh、E.coli BL21 DE（3）/pETDuet-1-tao-fdh、E.coli BL21 DE（3）/pETDuet-1-fdh-tao、E.coli BL21 DE（3）/pETDuet-1-fdh-tao&pCDFDuet-1-fdh。结果得到:菌株E.coli BL21 DE（3）/pETDuet-1-fdh-tao的TAO酶活最高,为3.27 U·OD^-1,相较于单表达TAO酶活提高了3倍。将上述最优体系应用于突变体TAO_3G2（V71L/G249C）中,得到E.coli BL21 DE（3）/p ETDuet-1-fdh-tao_3g2,酶活为4.11 U·OD^-1。（3）利用E.coli BL21 DE（3）/pETDuet-1-fdh-tao_3g2全细胞合成洋茉莉醛。为降低生产应用成本,使用乳糖代替传统诱导剂IPTG,优化诱导条件为:摇瓶发酵的初始诱导OD₆₀₀为0.95～2.20,乳糖浓度为4 g·L^-1,诱导温度为20～25oC,诱导时间为10 h。确定全细胞催化合成洋茉莉醛的条件为:菌体浓度为7.5～10%,底物添加量为20～25 g·L^-1,底物与辅底物的摩尔比为1:2。最终在3 L发酵罐上进行发酵以及底物转化实验,发现:在3 L发酵罐可获得的最终菌体OD₆₀₀为18.84,以浓度为25 g·L^-1的底物进行生物催化,转化7 h后,可得18.47 g·L^-1的洋茉莉醛,摩尔转化率为79.79%,时空催化效率为2.64g·（L·h）^-1。经初步提取,可得到纯度为98.63%的洋茉莉醛晶体。