香猪源性双歧杆菌的耐氧驯化及高密度发酵的研究

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双歧杆菌已成为人类公认的一种益生菌,具有降胆固醇、改善机体肠道微生物的平衡,调节机体免疫反应等多项生理功能。本课题从贵州特色资源香猪肠道內溶物中筛选得到了一株动物双歧杆菌乳亚种BZ11,并测定了其耐氧性、耐酸耐胆盐、降胆固醇率、抑菌性、粘附性等方面的生理性能;针对双歧杆菌专性厌氧特性采用三种方法进行了耐氧驯化,并对驯化后的菌株分别进行了不同方式的分批培养和分批补料培养,根据菌株在培养过程中的生长曲线确定出最有效的高密度发酵方式。得到以下主要结论:(1)菌株BZ11在有氧条件下培养24 h后活菌数可以达到3.80×108cfu/mL,即该菌株本身就具有较好的耐氧性能;菌株在pH 3条件下培养2 h存活率达到(98.65±0.11)%,在含0.3%胆盐浓度的培养基中培养24 h后存活率仍能达到80%以上,且均显著高于所选用的对照菌株动物双歧杆菌BZ25和金双歧,表明该株菌具有较好的耐酸、耐胆盐特性;能够粘附在Caco-2细胞表面,粘附细菌数为(6.66±0.32)cfu/cell。体外对胆固醇降解率达到(27.10±0.92)%;菌株BZ11对大部分抗生素较敏感;菌株BZ11的发酵液对六种病原菌具有不同的抑制效果,小鼠灌胃实验结果表明菌株BZ11无急性毒性。(2)为了提高动物双歧杆菌乳亚种BZ11对有氧环境的耐受性,采用逐渐增加培养基中的氧分压和有氧、厌氧条件下交替培养两种方案对其进行了耐氧驯化,并通过化学诱变选育耐氧菌株。通过对驯化前后菌株的生长特性进行分析得出逐渐增加培养基中的氧分压的驯化方案取得了更好的效果。经最优方案驯化后的菌株在有氧条件下培养20 h后,活菌数可达到6.30×108 cfu/mL,是初始菌株的2.24倍。驯化后菌株的降胆固醇率为(27.31±0.80)%,与初始菌株相比没有显著性差异(p>0.05)。通过鉴定得出,动物双歧杆菌乳亚种BZ11在耐氧驯化前后保持了相似的形态及生理生化特征。因此,驯化后的菌株有望作为一株潜在益生菌被开发利用。(3)采用了含有胡萝卜汁和卷心菜汁的优化的培养基对耐氧驯化后的菌株BZ11在5 L发酵罐分别进行了不同方式的分批培养和分批补料培养,最后得出当采用膜过滤—耦合分批补料培养方式对菌株培养72 h后,活菌数可达到2.29×1010 cfu/mL,是恒pH分批培养的9.8倍,是恒速分批补料培养的12.8倍,是重复分批补料培养的8.9倍,达到了人们将其进行食品或医药添加所需的活菌数要求。
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