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非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)的引发的一种高度传染性疾病。我国将其列为一类疫病,而世界动物卫生组织(OIE)将其作为必须报告的一种动物流行病。CRISPR/Cas9系统最初被发现为天然微生物免疫机制以防止侵入病毒或其他遗传元件。该途径的适应性在于使用位点特异性DNA双链断裂实现有效的基因组编辑,使得天然CRISPR系统以非常高的准确度特异性编辑哺乳动物基因组。此前,研究人员在ASFV免疫佐剂,减毒疫苗,DNA疫苗和亚单位疫苗方面做了大量工作(p72,p30,p54和p12)。但不幸的是,临床试验表明,这些疫苗都没有提供良好的保护效率。最近的研究发现,建立非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9敲除技术平台将为开发非洲猪瘟基因缺失的有效活疫苗提供可能。本文针对非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9敲除载体库的构建及初步应用做了以下内容研究:1.克隆ASFV SY18毒株中CD2v、UK(DP96R)启动子,分别构建含不同启动子和eGFP报告基因重组载体。并将其转染至人胚肾细胞(293T)、猪肾细胞(PK15)、非洲绿猴肾细胞(Vero)和传代的猪肺泡巨噬细胞(IPAM)中观察启动子活性,进一步研究ASFVSY18株哺乳动物细胞中同一区域启动子特异性转录调控的特点和机制。2.针对CD2v蛋白合成五条KLH偶联的多肽,制备抵抗素合成肽及其抗体。为ASFV CD2v蛋白分子功能的研究及CD2v蛋白的机制研究提供了有用的工具。3.构建并筛选基于非洲猪瘟的49个基因的重组gRNA(向导RNA)表达质粒,建立ASFV基因组CRISPR敲除gRNA库,并针对P30基因的gRNA鉴定其切割效率和免疫活性,为后续针对该基因对非洲猪瘟制定相应的免疫防控策略奠定了基础。4.建立了一种针对SY18株P72基因发快速、准确的非洲猪瘟病毒分子检测方法,为我国非洲猪瘟疫情的快速确诊提供了必要的分子诊断工具。