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转录调控是分子生物学领域中研究最广泛的调控机制之一,而RNA聚合酶全酶(RNAP)在该机制中发挥着主要的作用。它主要包含核心酶与sigma因子两个组成成分,能够特异结合启动子从而开始进行转录。其中,Sigma因子特异识别启动子元件并促进起始转录的进行。Sigma因子不仅是RNAP的一个独特亚基,而且也是信号转导系统的重要组成部分,其作为主调控因子,调控多个生物代谢过程。RpoD蛋白属于sigma因子家族成员蛋白,在微生物的生长发育、生物代谢以及一些胁迫应答调控中发挥着重要的作用。本研究利用巴西固氮螺菌(Azospirillum.brasilense Az39、Azospirillum.brasilense Sp7)、产脂固氮螺菌(Azospirillum.lipoferum 4B)、腐质霉固氮螺菌(Azospirillum.humicireducens SgZ-5)、固氮螺菌(Azospirillum sp.B510)、喜硫固氮螺菌(Azospirillum.thiophilum BV-S)这6个已经完成基因组测序的固氮螺菌基因组,经比对得到RpoD基因保守序列,并以巴西固氮螺菌L25的DNA为模板,对RpoD基因序列进行了克隆及其验证、在大肠杆菌BL21体内进行了表达以及碳源利用功能分析和一些耐受胁迫能力分析。此外,为构建RpoD-GFP融合蛋白表达载体,以质粒pCR2.1-TOPO-GFP为模板,对绿色荧光蛋白基因GFP进行了克隆、验证及表达。获得以下结果:1、克隆得到的RpoD基因,其全长为1959 bp,且编码653个氨基酸,具有一个sigma70家族的保守结构域,属于sigma因子中sigma70蛋白家族成员的第一类基础sigma因子;系统进化树分析显示,L25菌的RpoD基因与其同属的巴西固氮螺菌来源的亲缘关系最近;将该基因插入表达载体pET-32a(+)上,构建得到pET-32a-RpoD重组质粒。2、外源RpoD基因在大肠杆菌BL21体内诱导表达经SDS-PAGE检测,在约100KD处有一条明显亮带,得到pET-32a(+)载体部分序列与目的基因的融合蛋白,说明外源RpoD基因在大肠杆菌体内成功表达。3、外源RpoD基因在大肠杆菌BL21体内的碳源利用功能分析表明:外源基因RpoD在大肠杆菌BL21体内的表达,使菌体对碳源的利用种类明显增多,且对其中有些碳源的利用能力增强,但同时对少数几类碳源的利用能力减弱甚至消失。4、外源RpoD基因对大肠杆菌BL21耐受胁迫因子的响应功能分析表明:含外源RpoD基因的大肠杆菌BL21在高温、高渗透压、氧化、IPTG以及酸性等胁迫环境下,其耐受胁迫和生长情况较不含外源RpoD基因的对照菌大肠杆菌BL21差异显著。其中,在高温、IPTG等胁迫条件下,外源RpoD基因的表达对大肠杆菌BL21耐受胁迫能力起促进作用;而在氧化、酸性以及高渗透压等胁迫下,外源RpoD基因的表达对大肠杆菌BL21耐受胁迫能力既有促进也有抑制作用。另外,克隆得到绿色荧光蛋白基因GFP,并成功构建得到重组质粒pET-32a-RpoD-GFP;利用诱导剂IPTG对含该重组质粒的大肠杆菌BL21进行诱导表达,得到含有pET-32a-RpoD-GFP重组质粒的浅绿色菌株,说明GFP基因在大肠杆菌体内成功表达,此结果有助于后续RpoD基因转入固氮菌体进行筛选与鉴定。以上试验结果说明RpoD蛋白是一类能够对外界胁迫环境进行响应,同时也能调节和控制宿主菌某些代谢途径的全局调控因子,为RpoD基因在固氮菌或其他功能菌株中的耐胁迫能力以及一些生物功能的深入研究奠定基础。