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地黄始载于《神农本草经》,被列为上品,来源于玄参科植物地黄(Rehmαnnia glutinosa Libosch)的块根。常用品有生地黄和熟地黄,生地黄性寒,具有清热凉血,养阴生津功效;经炮制后的熟地黄,性温,具有补血滋阴、益精填髓的功效。传统炮制方法较为认可的是"九蒸九制",《雷公炮制论》、《成方切用》等古籍中均有记载,有上千年历史,其科学内涵有待深入研究。本论文在"整体观"思想指导下,结合中药"多成分多靶点"的作用特点,采用基于色-质联用技术的非靶标中药次生代谢物组学和靶标中药糖组学方法分别表征生、熟地黄次生代谢物组和糖组,阐明"九蒸九制"地黄整体"质"的变化规律;采用基于色-质联用技术的效应代谢组学方法表征内源性代谢产物组,并结合多种经典药效指标,阐明"九蒸九制"地黄整体"效"的变化规律;为客观诠释地黄"九蒸九制"传统炮制工艺的科学内涵和创新工艺优化提供科学依据。一、论文选题依据及相关文献综述本章归纳总结了地黄炮制化学、药理和质量控制方法研究进展;指出目前研究中存在的不足,在此基础上提出了本论文的研究思路和策略:以地黄"九蒸九制"为研究对象,在"整体观"思想指导下,结合中药"多成分多靶点"的特点,综合运用中药次生代谢物组学、糖组学和效应代谢组学研究方法,探寻"九蒸九制"对地黄整体质/效的影响规律。二、基于中药次生代谢物组学和中药糖组学的地黄炮制化学研究采用基于非靶标中药次生代谢物组学和靶标中药糖组学的方法分别表征生、熟地黄中次生代谢物组和糖组,阐明"九蒸九制"地黄整体"质"的变化规律。采用基于UPLC-PDA-QTOF-MS/MS中药次生代谢物组学技术表征生、熟地黄次生代谢物组,共鉴定次生代谢物41个,主要为环烯醚萜及其苷类、苯乙醇苷和呋喃醛衍生物等化合物,结合SIM扫描模式,定量其中有代表性化合物7个;采用基于整合多维色谱(HPGPC-ELSD、HPLC(C18)-UV 及 HPLC(NH2)-ELSD)的中药糖组学技术表征生、熟地黄糖组,表征多糖分子量分布及5个单糖组成,定量了5个游离单糖和5个寡糖。结果显示,"九蒸九制"过程中,次生代谢物组和糖组均发生较为明显的量变与质变,综合炮制过程中各类成分含量变化趋势,归纳地黄炮制过程中可能的化学转化机制。多变量统计分析(PCA)结果显示,"九蒸九制"对糖组和次生代谢物组的影响趋势不一致,五次蒸制后,糖组趋于均一,而六次蒸制后,次生代谢物组才趋于均一,表明若单独研究某一类成分,不利于药材整体质量的评价。整合次生代谢物组学和糖组学分析,六次蒸制后熟地黄品质趋于稳定和均一。三、地黄炮制过程化学转化机制探讨结合第二章分析结果,以生地黄(RRR0)和熟地黄6-9(PRR6-9)为研究对象,利用多变量统计分析(PCA和OPLS-DA),从次生代谢物组和糖组共挖掘出区别生、熟地黄的化学标志物14个,进一步对化学标志物进行模拟炮制,采用基于UPLC-PDA-QTOF-MS/MS靶标化学物质组学鉴定炮制产物,从而探究地黄炮制过程化学成分转化机制。从次生代谢物组中共挖掘并鉴定了 5个化学标志物,分别为苷类成分(地黄苷D、地黄苷A/B和毛蕊花糖苷)和呋喃醛衍生物(5-HMF及其单糖苷和二糖苷);从糖组中共挖掘了 8个化学标志物,分别为单糖(果糖、葡萄糖)、寡糖(蜜二糖、蔗糖、甘露三糖、棉子糖和水苏糖)和多糖。选取有代表性化学标志物的对照品,模拟蒸制过程,采用UPLC-PDA-QTOF-MS/MS分析技术,探寻地黄炮制过程中化学转化机制,发现炮制过程中糖类成分和苷类成分通过脱水或脱糖基转化为呋喃醛衍生物。四、基于效应代谢组学的生、熟地黄补血作用及机制研究在明确"九蒸九制"对地黄品质影响规律的基础上,选取RRR0、PRR6和PRR9为研究对象,以炮制后补血作用增强为切入点,采用基于UPLC-QTOF-MS/MS效应代谢组学表征血虚大鼠内源性代谢产物组及其在生、熟地黄干预下的变化,揭示生、熟地黄体内代谢调控机制;再结合经典药效指标,比较生、熟地黄对血虚大鼠的补血作用,研究"九蒸九制"对地黄补血作用的影响规律。采用环磷酰胺及乙酰苯肼复合法复制大鼠血虚模型,考察各组大鼠的外观状态、死亡率、体重、外周血常规和脏器指数,发现地黄及其炮制品对血虚大鼠补血强度趋势为PRR6>PRR9>RRR0。应用基于UPLC-QTOF-MS/MS的效应代谢组学方法,表征生、熟地黄干预后机体内源性代谢产物组的变化,通过量化PLS-DA得分图可知,补血强度趋势为PRR6≈PRR9>RRR0。通过正常组与模型组比较,从血浆和尿液中共挖掘出41个潜在生物标志物,主要涉及6个代谢通路(impact>0.10);PRR9和RRR0能显著回调的生物标志物(P<0.05)主要涉及 pentose and glucuronate interconversions 和 sphingolipid metabolism 通路,PRR6除涉及上述通路外,还涉及glyoxylate and dicarboxylate metabolism通路。综合经典药效指标和效应代谢组学可知,地黄补血强度趋势为PRR6>PRR9>RRR0。五、基于效应代谢组学的生、熟地黄滋阴作用及机制研究选取RRR0、PRR6和PRR9为研究对象,以炮制后滋阴作用增强为切入点,采用效应代谢组学研究手段,表征肾阴虚大鼠内源性代谢产物组及其在生、熟地黄干预下的变化,揭示生、熟地黄体内代谢调控机制;再结合经典药效指标,比较生、熟地黄对肾阴虚大鼠的滋阴作用,研究"九蒸九制"对地黄滋阴作用的影响规律。以左旋甲状腺素钠作用下的肾阴虚模型,考察各组大鼠的外观状态、体重和脏器切片,发现地黄及其炮制品对肾阴虚大鼠滋阴强度趋势为PRR6≈PRR9>RRR0。应用基于UPLC-QTOF-MS/MS的效应代谢组学方法,表征生、熟地黄干预后机体内源性代谢产物组的变化,通过量化PLS-DA得分图可知,滋阴强度趋势为PRR9>PRR6>RRR0。通过正常组与模型组比较,从血浆和尿液中共挖掘出46个潜在生物标志物,主要涉及7个代谢通路(impact>0.10);PRR6能显著回调的生物标志物(P<0.05)主要涉及sphingolipid metabolism通路,RRR0主要涉及pentose and glucuronate interconversions通路,PRR9除涉及上述通路外,还涉及tryptophan metabolism通路。综合经典药效指标和效应代谢组学可知地黄滋阴强度趋势为PRR9>PRR6>RRR0。