研究背景：在上世纪中叶,人们对酒精引起的脂肪肝就有所认识,长期大量饮酒可导致酒精肝,这种效应对长期饮酒者可达99%以上。但对其机制的认识与研究主要放在脂肪代谢与能量平衡的生化角度上去论述,对酒精引起脂肪肝的发病原因和途径远没有弄清楚。在脂肪肝形成过程中,大量的肝细胞可转分化为脂细胞,这将严重影响肝脏的解毒功能,继而会影响神经、肾脏的功能,其后果非常严重,更严重的是脂肪肝会进一步发展成酒精性肝炎、肝硬化,甚至肝癌。我们国家饮酒的人日益增多,长期饮酒所引发的肝性疾病给个人、家庭及社会都造成了很大的负担。我们只有弄清楚酒精肝的发病机制,才能真正找到预防的措施,为酒精性脂肪肝的治疗提供实验和理论基础。因此,此研究具有实际意义。研究目的：通过体外细胞实验,分别原代培养非分离纯化肝脏细胞和分离纯化肝细胞,通过形态学、细胞化学、分子学等检测方法,观察酒精处理实验组与正常对照组相比较肝细胞发生的各种变化,进而探讨酒精引起肝细胞脂肪性病变的机制,为研究酒精性肝病的治疗药物及临床酒精性肝病的防治提供实验依据。研究方法：以体外原代培养5天龄KM乳小鼠肝细胞为实验材料,进行下列实验：1.采用胰蛋白酶组织消化法体外原代、贴壁培养乳小鼠肝脏细胞；2.原代培养乳小鼠肝脏细胞,细胞分离液分离纯化,获得单一、高纯度的肝细胞；3.实验分组：实验分为肝细胞未分离纯化原代培养(第1组)与分离纯化原代培养(第Ⅱ组)两大组,每大组均设置正常对照组和酒精处理实验组(设50、100、200、300、400mmol／L5个酒精处理浓度)；4.形态学观察未分离纯化原代培养中的细胞类型及分离纯化后的肝细胞；5.细胞化学PAS糖原染色法鉴定两大组中的肝细胞；6.免疫细胞化学染色法鉴定两大组中的Kupffer细胞；7.油红0染色法检测酒精处理两大组细胞之后,肝细胞发生脂肪变性的程度,并用异丙醇萃取油红0染液后,酶标仪测定波长在510nm处的吸光度值定量分析脂肪变性的程度；8.酒精处理两大组细胞之后,TR工zol裂解细胞提取总RNA.RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳,ImageJ软件对电泳图谱进行定量分析,检测PPAR α与PPAR γ mRNA活性水平的变化；9.酒精处理两大组细胞之后,TRIzol裂解细胞提取总RNA.RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳,ImageJ软件对电泳图谱进行定量分析,检测免疫因子TNF—α与IL-6mRNA活性水平的变化。结果：1.形态学观察：倒置相差显微镜下,未分离纯化原代培养的肝脏细胞有多种种类；分离纯化后得到单一、纯度较高的肝实质细胞(肝细胞)。肝细胞呈球形、椭圆形或多边形,边界清晰,胞质色淡,胞核位于正中,为单核或双核；Kupffer细胞体积较大,呈球形或椭圆形；星形细胞呈不规则形,边缘伸展出伪足。2.PAS糖原鉴定：将原代培养的细胞种于飞片上,PAS染色后,倒置相差显微镜下可以观察到肝细胞胞质内由于含有大量的糖原颗粒而显示红色。未分离纯化原代培养的肝脏细胞只有一部分细胞显示红色,而分离纯化后几乎90%以上的细胞显示红色。3. KuDffer细胞鉴定：采用免疫细胞化学染色的方法,选用KuDffer细胞表面特异性抗原分子CD68做标志性染色,荧光显微镜下观察到Kupffer细胞表面由于特异性抗原分子CD68的存在而显示红色。未分离纯化原代培养的肝脏细胞中有一小部分细胞显示红色,而分离纯化后几乎没有细胞显示红色。4.油红0染色鉴定脂肪细胞：采用细胞化学染色的方法,对酒精处理后的两大组细胞染色,油红0为脂溶性染料,在脂肪内能高度溶解,可特异性使组织内的甘油三酯等中性脂肪着色,被染成红色。未经分离纯化原代培养的肝脏细胞,酒精处理、油红0染色后部分细胞胞质内显示红色,相比较,分离纯化的肝细胞酒精处理、油红0染色后几乎很少有细胞胞质内显示红色。5. PPAR α与PPAR γ mRNA活性水平的变化：用ImageJ图像分析软件分析PCR扩增后的电泳图谱,其mRNA相对表达量的分析结果显示：1)第1组,实验组不同酒精处理浓度PPAR α的mRNA活性水平分别与正常对照组相比较,结果表现为差异有统计学意义(P<0.05),且随着酒精处理浓度的升高,有降低的趋势；实验组不同酒精处理浓度PPARγ的mRNA活性水平分别与正常对照组相比较,结果表现为差异有统计学意义(P<0.05),且随着酒精处理浓度的升高,有升高的趋势；2)第Ⅱ组,各比较结果表现为差异没有统计学意义(P>0.05)。6.免疫因子TNF-α与IL-6mRNA活性水平的变化：用ImageJ图像分析软件分析PCR扩增后的电泳图谱,其mRNA相对表达量的分析结果显示：1)第1组,实验组不同酒精处理浓度TNF-α与IL-6m的RNA活性水平分别与正常对照组相比较,结果表现为差异有统计学意义(P<0.05),且随着酒精处理浓度的升高,TNF-α与IL-6mRNA活性水平均有升高的趋势：2)第Ⅱ组,各比较结果表现为差异没有统计学意义(P>0.05)。结论：1.本研究选用5d龄的KM乳小鼠作为实验材料,它是获取肝脏细胞的理想材料;2.本研究采用胰蛋白酶组织消化、贴壁培养法进行体外原代培养肝脏细胞,并采用细胞分离液、适当的离心条件成功获得纯度较高的肝细胞；3.本实验对脂肪细胞的鉴定选用油红0染色的方法,并用异丙醇萃取油红0染液测定波长在510nm处的吸光度值,对脂肪变性进行定量分析；4.经酒精处理后,与分离纯化原代培养的肝细胞相比较,未分离纯化原代培养的肝脏细胞,发生了肝细胞向脂肪细胞转变的现象；PPAR α的mRNA活性水平较其正常对照组(没有用酒精处理)有明显的降低；而PPAR γ、TNF-α及IL-6的mRNA活性水平较其正常对照组有明显的升高；5.纯化的肝细胞不易形成脂细胞；酒精处理肝脏细胞时,可能是肝脏中的肝细胞在非实质细胞及其产生的因子(包括免疫因子)的作用下发生了肝细胞脂肪变性即去分化或转分化的现象。