论文部分内容阅读
目的:观察电针傍刺对于大鼠压疮损伤愈合过程中压疮面积变化、血流变化、微血管计数、血管内皮细胞计数、Ras、c-Raf、p-MEK1、MEK1、p-ERK1、ERK1蛋白表达、MEK1mRNA及ERK1 mRNA表达的影响,探讨电针治疗压疮的作用机理。方法:1.雌性健康清洁级SD大鼠120只,体重200-250g,在温度20±2℃、湿度40-50%RH、自然光照环境中适应性喂养1周,期间单笼喂养,自由进食,饮水。将120只大鼠采用随机数字表法随机分为电针组、电针+抑制剂组、模型组、空白组4组,每组30只,每组依据接受治疗时间长度分为1d、3d、5d、7d、9d共5个亚组,每个亚组纳入大鼠6只。2.采用自制压疮造模装备制作Ⅱ期压疮后给予治疗。电针组采用傍刺针刺手法,以疮面中心为第一进针点,深度为0.2寸,距离疮面内侧边缘0.5cm处为第二进针点,平刺入皮下,针灸针方向与大鼠腿部肌肉纹理走向相一致,不施手法,连接微电流电刺激仪进行治疗(电流:500μA,0.5HZ,30min/次,1次/日),其中负极置于损伤的皮肤中心,正极连接损伤皮肤外侧。电针+抑制剂组每次治疗前1h用微量注射器尾静脉注射PD98059(剂量为0.3mg/kg)[138],针刺之后连接电刺激仪,通电治疗。模型组碘伏消毒处理。空白组捆绑方式同以上各组,但不予任何治疗。除电针+抑制剂组外其余各组大鼠治疗前均需注射与PD98059等体积的生理盐水。3.分别在造模后、1d、3d、5d、7d、9d治疗后使用求积仪硫酸盐薄膜透绘法测量压疮面积变化,使用血流仪测量各组大鼠疮面血流变化。4.采用HE染色法检测各组大鼠压疮皮肤组织中微血管计数、血管内皮细胞计数。5.采用免疫组织化学法检测各组大鼠压疮皮肤组织中Ras、c-Raf蛋白表达水平。6.采用蛋白质印迹技术(Western-blot)检测各组大鼠压疮皮肤组织中MEK1、ERK1蛋白表达及其磷酸化水平。7.采用实时荧光定量Real-Time PCR技术检测各组大鼠压疮皮肤组织中MEK1mRNA、ERK1mRNA的表达差异。结果:1.压疮面积测量结果显示:治疗1d时模型组、电针组、电针+抑制剂组三组相比较,各组间压疮愈合率无明显差异(P>0.05);余下各时间点从3d～9d,电针组与模型组相比较,电针组压疮愈合率高于模型组,二者之间具有显著性差异(P<0.01);电针组与电针+抑制剂组比较,电针组压疮愈合率优于电针+抑制剂组,二者之间差异显著(P<0.01)。2.大鼠压疮皮肤血流观测:与空白组相比较,1～3d模型组大鼠压疮观测区域血流量显著升高,二者差异显著(P<0.05),5～9d模型组大鼠压疮观测区域血流量明显降低,二者差异显著(P<0.05);与模型组比较,1～3d电针组大鼠治疗后压疮观测区域血流量显著降低,二者间差异显著(P<0.05),5～9d电针组大鼠治疗后压疮观测区域血流量显著升高,二者之间差异显著(P<0.05);与电针组相比较,电针+抑制剂组各时间点大鼠治疗后压疮观测区域血流变化趋势二者相同,并且血流量无明显差异(P>0.05)。3.HE染色结果观测:(1)与空白组相比较,1d～7d模型组、电针组、电针+抑制剂组内微血管数目明显少于空白组,组间可见明显差异(P<0.05);与模型组相比较,3d～7d电针组微血管数目明显优于模型组,二者组间差异显著(P<0.01或P<0.05);与电针组相比较,3d～7d电针+抑制剂组内微血管数目明显少于电针组,二者组间差异显著(P<0.05);9d时间点各组相比较,各组之间微血管数量相当,各组之间未见明显差异(P>0.05)。(2)与空白组相比较,1d～7d模型组、电针组、电针+抑制剂组内血管内皮细胞计数明显少于空白组,组间可见明显差异(P<0.05);与模型组相比较,3d～7d电针组血管内皮细胞计数明显优于模型组,二者组间差异显著(P<0.01或P<0.05);与电针组相比较,3d～7d电针+抑制剂组内血管内皮细胞计数明显少于电针组,二者组间差异显著(P<0.05);9d时间点各组相比较,各组之间微血管数量相当,各组之间未见明显差异(P>0.05)。4.免疫组化结果显示:(1)Ras蛋白在大鼠压疮皮肤组织中的阳性表达定位于细胞浆,颜色呈黄色或棕黄色。在压疮损伤出现后,与空白组相比较,1d模型组、电针组、电针+抑制剂组各组之间Ras蛋白表达无明显差异(P>0.05),3d～9d模型组Ras蛋白表达量明显下降,与空白组之间差异显著(P<0.05);与模型组相比较,3d～9d电针组Ras蛋白表达量明显升高,二者差异具有统计学意义(P<0.01);与电针组相比较,电针+抑制剂组在3d～9d各时间点Ras蛋白表达量略有下降,但两组间差异没有统计学意义(P>0.05)。各组内部5个亚组间相比较,模型组Ras蛋白表达在1d最高,然后逐渐下降,5d时表达水平最低,然后逐渐升高;电针组与电针+抑制剂组中Ras蛋白表达水平从1d～9d逐渐升高。(2)与空白组相比较,1d模型组、电针组、电针+抑制剂组各组之间c-Raf蛋白表达无明显差异(P>0.05),3d～9d模型组c-Raf蛋白表达量明显降低,与空白组之间差异显著(P<0.05);与模型组相比较,3d～9d电针组c-Raf蛋白表达量明显升高,二者差异具有统计学意义(P<0.01);与电针组相比较,电针+抑制剂组在3d～9d各时间点c-Raf蛋白表达量有所下降,但二者间差异没有统计学意义(P>0.05)。各组内部5个亚组间相比较,模型组内c-Raf蛋白表达水平在3d点最低,然后逐渐上升;电针组与电针+抑制剂组中c-Raf蛋白表达水平从1d～9d时间点逐渐升高,7d时间点后表达水平上升的趋势有所减缓。5.Western-blot结果显示:与空白组比较,1d模型组、电针组、电针+抑制剂组之间4种蛋白表达水平无明显差异(P>0.05);3d～9d模型组MEK1、p-MEK1、p-ERK1等蛋白表达显著增多,3种蛋白表达组内峰值均出现于5d时间点,与空白组间差异具有统计学意义(P<0.05),ERK1表达水平未见明显差异(P>0.05);与模型组相比较,MEK1、p-MEK1、p-ERK1在3d～9d电针组中的表达水平均有显著增高,差异具有统计学意义(P<0.01),组内峰值出现于3d时间点,ERK1表达水平未见明显差异(P>0.05);与电针组相比较,MEK1、p-MEK1、p-ERK1在3d～9d电针+抑制剂组中的表达水平略有下降,这种下降趋势具有统计学意义(P<0.05),组内峰值出现于3d时间点,与3d电针组相比,3种蛋白表达水平均低于电针组,组间差异显著(P<0.05),ERK1表达水平未见明显差异(P>0.05)。6.Real-TimePCR结果显示:与空白组相比较,1d模型组、电针组、电针+抑制剂组各组之间MEK1mRNA、ERK1 mRNA表达水平无明显差异(P>0.05);3～9d模型组中MEK1mRNA的表达水平升高,优于空白组,二组间差异具有统计学意义(P<0.05),模型组内MEK1mRNA表达峰值出现于5d时间点,ERK1mRNA表达水平未见明显变化(P>0.05);与模型组相比较,MEK1mRNA在3～9d电针组中的表达水平有显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05),电针组内MEK1mRNA表达峰值出现于3d时间点,ERK1 mRNA表达水平未见明显变化(P>0.05);与电针组相比较,MEK1mRNA在3～9d电针+抑制剂组中的表达水平略有下降,这种下降趋势具有统计学意义(P<0.05),ERK1mRNA表达水平有所下降,但组间未见明显差异(P>0.05)。结论:1.电针傍刺能够有效促进压疮愈合。2.电针傍刺对于压疮皮肤血运重建具有正向调节作用。3.MAPK/ERK信号通路参与压疮修复过程,提高Ras、c-Raf、MEK1、p-MEK1蛋白、p-ERK1蛋白、MEK1mRNA表达水平,促进血管内皮细胞增殖,加速微血管再生重构,可能是电针傍刺治疗压疮的机理之一。