研究背景和目的国内外肺癌的发病率和死亡率持续上升,在人口密度较高的工业城市尤为显著;在男性肿瘤死因中已居首位,在女性中仅次于乳腺癌居第二位,且有年轻化趋势,而肺癌的治疗和预后不容乐观。因此深入研究肺癌的病因、发病机制,探索有效的防治方法已是当前肿瘤研究的首要任务。ABCG2是ABC转运蛋白超家族(ATP binding cassette transportersuperfamily)成员之一,是1998年从耐药的乳腺癌细胞中克隆,并引起耐药的基因,所以又叫乳腺癌耐药蛋白(BCRP breast cancer resistance protein)基因。与其他研究小组发现的MXR(mitoxantrone resistance protein)和ABCP(placental ABC protein)有着结构和序列的相似性,同属于ABCG基因家族,因此人类基因组命名委员会将其统一命名为ABCG2。ABCG2蛋白是半转运蛋白,由6个跨膜螺旋结构域和一个氨基端胞内核酸结合结构域以及相应的一个ATP-binding cassette组成,因此要通过与自身或其他半转运体组成同型或异型二聚体或多聚体后才能发挥作用。包括ABCG2在内的转运蛋白超家族正是通过转运复合体的形成在宿主对异物的防御和肿瘤细胞对抗癌药物的耐药性中起重要作用。研究还发现ABCG2/Bcrp1与造血干/祖细胞泵出Hochest33342染料的特性有关。部分干细胞和癌细胞可以将Hochest33342排出细胞,表现为核不着色或着色很少,流式细胞仪可以将不着色细胞分离,分离出的这部分细胞称为SP细胞。目前认为ABCG2就是SP细胞的表型标志,是潜在的干细胞标志物。因此,ABCG2既是一个新的耐药基因,又和SP细胞、肿瘤干细胞密切相关,研究其在肺癌中的表达,分析其与临床病理特征的关系,揭示其对肺癌细胞基本生物学特性的影响,有助于深入研究ABCG2与肺癌的关系,可能会为肺癌的发生和防治提供新策略。方法1.ABCG2在肺癌中表达的定量研究(1)应用免疫组化(SP法)观察了86例肺癌(鳞癌42例、腺癌31例、大细胞癌5例,小细胞癌8例,其中伴淋巴结转移者33例)和24例癌周肺组织(距肿物5cm)ABCG2蛋白的表达;(2)应用原位杂交观察了86例肺癌组织中(鳞癌42例、腺癌31例、大细胞癌5例,小细胞癌8例)ABCG2mRNA的表达;(3)应用显微图像定量分析,测试靶细胞ABCG2蛋白及mRNA表达的阳性单位(PU)值。2.ABCG2基因沉默对肺癌细胞体外生物学特性的影响(1)在倒置显微镜下观察肺腺癌细胞GLC-82和A549的形态学特点;应用HE细胞爬片和组织切片比较二者形态异同;应用免疫细胞化学、细胞原位杂交、RT-荧光定量PCR、western-blot和Hoechst33342染色比较GLC-82和A549中ABCG2基因表达程度。(2)应用基因转染方法,将含有不同片段的4个干扰质粒、一个阳性对照质粒和一个阴性对照质粒,通过脂质体分别转入GLC-82,用G418反复筛选纯化克隆。用RT-PCR法鉴定阳性对照中GAPDH的干扰效率,再用RT-荧光定量PCR(RT-QPCR)法鉴定各干扰各隆的干扰效率,并通过免疫细胞化学和westernblot验证。(3)应用MTT法测OD值并绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞周期分布,克隆形成实验检测单细胞克隆形成率,比较干扰前后细胞生长增殖能力的改变;应用划痕实验观察细胞迁移速度,观察ABCG2沉默对肺癌细胞转移能力的影响;应用倒置显微镜、细胞爬片、扫描电镜和透射电镜观察干扰前后细胞的形态学改变;应用MTT法检测干扰前后细胞对顺铂耐药性的改变。3.ABCG2基因沉默对肺癌细胞皮下成瘤的影响通过动物实验裸鼠皮下成瘤观察干扰前后细胞成瘤过程和成瘤能力的变化,绘制体内生长曲线,行HE染色观察其组织学形态的变化。结果1.ABCG2蛋白主要表达在肺腺癌和肺鳞癌的原发灶和转移灶以及癌周肺组织小支气管上皮腔侧及管壁腺体,肺大细胞癌和小细胞癌不表达;显微图像定量分析表明:(1)肺癌原发灶ABCG2蛋白表达PU值在肺鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞间总体比较,差异具有显著性(F=15.857,P＜0.001),其中肺鳞癌和腺癌与各组比较差异均有显著性(P＜0.05),且肺腺癌表达PU值高于肺鳞癌(P＜0.01)。(2)癌周肺组织ABCG2蛋白表达PU值高于肺癌原发灶(t=5.158,P＜0.001);分别与各型肺癌总体比较差异有显著性(F=22.470,P＜0.001),PU值高于肺鳞癌、大细胞癌和小细胞癌,差异均有显著性(P＜0.05),但与腺癌之间的差异无显著性(P＞0.05)。(3)肺癌淋巴结转移灶中各型肺癌ABCG2蛋白表达PU值总体比较差异有显著性(F=7.804,P=0.001),其中肺鳞癌和腺癌与各组比较差异均有显著性(P＜0.05),大细胞癌和小细胞癌之间比较差异无显著性(P＞0.05);肺癌原发灶与其淋巴结转移灶相比,ABCG2蛋白表达的PU值差异无显著性(t=1.388P=0.169);各型肺癌原发灶与其淋巴结转移灶ABCG2蛋白表达的PU值相比,差异亦无显著性(P＞0.05)。(4)ABCG2蛋白表达PU值与肺癌患者的性别、年龄、转移和TNM分期无关(P＞0.05),与肺癌分化程度有关(F=65.385 P＜0.001),分化越高,ABCG2蛋白表达PU值越高。2.ABCG2mRNA主要表达在肺腺癌和肺鳞癌中,肺大细胞癌和小细胞癌不表达,显微图像定量分析表明:(1)ABCG2mRNA表达PU值在肺鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞间总体比较,差异具有显著性(F=12.155,P＜0.001),其中肺鳞癌和腺癌与各组比较差异均有显著性(P＜0.05),且肺腺癌表达的PU值高于肺鳞癌。(2)ABCG2mRNA表达PU值与肺癌患者的性别、年龄、转移和TNM分期无关(P＞0.05);与肺癌分化程度有关(F=57.895,P＜0.001),分化程度越高,ABCG2mRNA表达PU值越高。3.GLC-82和A549的比较:(1)倒置显微镜和细胞爬片HE染色观察表明:GLC-82和A549均为大小不一、形态多样。GLC-82以多边形上皮样细胞为主,梭形细胞只占极少数,镶嵌排列;A549以梭形、多角形细胞为主,散在、单层排列。GLC-82形态相对A549较一致;HE切片中GLC-82的成瘤组织可观察到类腺样结构,而A549均为弥漫散在排列。(2)免疫细胞化学检测:ABCG2蛋白在GLC-82和A549中呈阳性表达,表现为浆膜型:定量分析表明GLC-82中ABCG2蛋白PU值高于A549,差异有显著性(t=7.860,P＜0.001)。(3)细胞原位杂交结果显示:GLC-82和A549胞浆中出现棕黄色颗粒状阳性信号,定量分析表明GLC-82中ABCG2mRNA PU值高于A549,差异有显著性(t=8.958,P＜0.001)。(4)RT-QPCR检测ABCG2mRNA在GLC-82和A549中的表达,发现A549中ABCG2mRNA的表达仅是GLC-82的32%。(5)western blot检测ABCG2蛋白在GLC-82和A549中的表达,发现GLC-82中ABCG2蛋白含量高于A549(t=20.839,P＜0.001)。(6)Hoechst33342染色,发现GLC-82核染色略弱于A549。经图像定量分析,计算核染色PU值,发现GLC-82核染色PU值小于A549,差异有显著性(t=17.223,P＜0.001)4.ABCG2干扰载体转入细胞,经筛选纯化,获得1个阳性对照克隆(GLC-82/P),10个干扰克隆和1个阴性对照克隆(GLC-82/N);(1)RT-PCR检测阳性对照中GAPDHmRNA的表达,结果发现GAPDHmRNA在阳性对照组(GLC-82/P)中表达低于GLC-82,仅为GLC-82的19%(t=11.490,P＜0.001)。(2)RT-QPCR检测各个克隆中ABCG2mRNA的相对表达量,发现克隆1和克隆2的相对表达量分别为20.11%和27.59%,即干扰效率分别为79.99%和72.49%。(3)免疫细胞化学检测克隆1(GLC-82/R)中ABCG2蛋白表达,定量分析表明,GLC-82、GLC-82/N和GLC-82/R总体比较差异有显著性(F=242.536,P＜0.001),GLC-82/R中ABCG2蛋白表达PU值低于GLC-82和GLC-82/N,差异具有显著性(P＜0.01),GLC-82和GLC-82/N间差异无显著性(P＞0.05)。(4)Westernblot检测GLC-82/R中ABCG2蛋白表达,GLC-82、GLC-82/N和GLC-82/R总体比较差异有显著性(F=77.190,P＜0.001),GLC-82/R中ABCG2蛋白表达相对值低于GLC-82和GLC-82/N,差异具有显著性(P＜0.01),GLC-82和GLC-82/N间差异无显著性(P＞0.05)。(5)经Hoechst33342染色,在荧光显微镜同等设置的条件下观察,发现GLC-82/R核染色强于GLC-82/N(t=35.107,P＜0.001)。5.通过比较GLC-82、GLC-82/N和GLC-82/R生物学特性,观察ABCG2沉默后导致的生物学特性改变,结果如下:(1)MTT法测OD值并绘制体外生长曲线,观察三组细胞体外增殖能力的改变,发现三者增殖能力差异有显著性(F=91.333,P＜0.001)。从第三天开始,GLC-82/R与GLC-82和GLC-82/N相比,细胞的增殖能力减慢,差异有显著性(P＜0.01);GLC-82和GLC-82/N差异无显著性(P＞0.05)。(2)运用流式细胞术,观察细胞周期分布,发现三组细胞周期分布在G2期、S期和G2/G1期均无显著性差异(P＞0.05);在G1期差异有显著性(F=5.208,P=0.49),其中GLC-82和GLC-82/N差异无显著性(P＞0.05),GLC-82/R的G1期细胞多于GLC-82和GLC-82/N,差异有显著性(P＜0.05)。三组细胞均未测出凋亡峰。(3)观察三组细胞克隆形成率,其克隆形成率差异有显著性(F=31.869,P＜0.001),GLC-82/R的克隆形成率低于GLC-82和GLC-82/N的克隆形成率(P＜0.01),GLC-82和GLC-82/N的克隆形成率差异无显著性(P＞0.05)。(4)通过划痕实验观察三组细胞迁移速度,发现不同时间和不同组别之间无交互作用(F=0.511,P=0.780);三组细胞之间划痕愈合率差异无显著性(F=0.511P=0.579)。(5)光镜和电镜(扫描电镜和透射电镜)下定性观察尚未发现干扰前后有明显差异。(6)通过MTT法检测三组细胞对顺铂耐药性的改变,发现三者半数抑制浓度(IC50)总体比较差异有显著性(F=32.828,P=0.001),两两比较差异均有显著性(P＜0.05)。GLC-82/R和GLC-82/N耐药指数亦下降,分别为0.314和0.589。6.GLC-82、GLC-82/N和GLC-82/R成瘤过程观察,及体内增殖能力比较(1)三组细胞体内增殖差异有显著性(F=26.102,P＜0.001),差异主要从第17天以后开始,GLC-82/R生长滞后于GLC-82和GLC-82/N(P＜0.01),GLC-82和GLC-82/N生长快慢差异无显著性(P＞0.05)。(2)处死裸鼠,取肿瘤,发现三组细胞均明显成瘤。三者肿瘤体积(F=5.920,P=0.013)和体重(F=4.114,P=0.038)比较差异有显著性,GLC-82/R成瘤较小(P＜0.01)。(3)形态学观察:肉眼均为灰白色,结节状。镜下:肿瘤细胞弥漫浸润性生长,罕见腺腔样结构,伴有出血坏死,可见纤细的纤维结缔组织间隔。肿瘤细胞大小不一,形态各异。可见单核、双核、多核细胞及多核巨细胞。细胞核染色质粗大,核仁明显,可见多个嗜酸性核仁,核分裂像易见,多为病理性核分裂。三组细胞成瘤后组织结构、细胞形态大致相似。结论1.ABCG2在不同类型和分化的肺癌中表达不同,可作为肺癌分型和判断肺癌分化程度的指标之一。2.ABCG2表达与肺癌患者的性别、年龄、转移和TNM分期无关,与肺癌分化程度有关,提示ABCG2在肺癌耐药中起一定作用。3.从蛋白和mRNA水平及功能方面证实了ABCG2在GLC-82中表达高于A549。4.建立了稳定的ABCG2基因沉默细胞株,为后续实验提供了理想的细胞模型。5.ABCG2基因沉默致肺癌细胞增殖变缓且对顺铂耐药性降低,提示其对肺癌细胞生物学特性有一定影响,这有助于进一步揭示ABCG2与肺癌之间的关系。创新之处1.首次从定量角度揭示了ABCG2蛋白和mRNA在肺癌中表达的特点及规律。2.建立了稳定的ABCG2表达沉默的肺癌细胞株,为肺癌的体外研究提供了理想的细胞模型,为各种肺癌动物实验模型的建立奠定了基础。3.首次系统性地研究ABCG2基因对肺癌细胞生物特性的影响,为深入研究肺癌的发生和治疗奠定基础。