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[背景]胃肠炎是当今世界分布最广泛最常见的疾病症状之一,其主要临床表现为腹泻、呕吐和腹痛。在发达国家和发展中国家均造成沉重的社会经济负担。我国从第一次大规模调查至今,胃肠炎的发病率从0.76次/人年降至0.56次/人年,尽管发病率有所下降,但依然给社会造成巨大的疾病负担。引起胃肠炎发病的病原体包括细菌、病毒和寄生虫。随着饮食安全和个人卫生意识的提高,以及抗感染的应用,病毒逐渐成为引发胃肠炎的主要原因之一。病毒性胃肠炎(Viral Gastroenteritis,VGE)可由多种不同的病毒引起,已经证实的病原体有诺如病毒(Norovirus,NoV)、轮状病毒(Rotavirus,RV)、星状病毒(Astrovirus,AstV)、札如病毒(Sapovirus,SaV)和肠道腺病毒(Adenovirus,AdV)。其中NoV和RV是导致VGE的主要原因,进行NoV和RV的分子流行病学研究能有效地监测区域内人群中的流行情况,为其导致的胃肠炎防控提供科学依据,并为研发诊断试剂和疫苗提供理论基础。目前针对胃肠炎病毒的监测研究多为基于病例标本的监测。环境污水监测是一种简便、灵敏、有效、快速的胃肠炎病毒监测手段,可以在病例监测系统尚未建立或并不完善的地区提供有价值的监测数据。其原理为NoV和RVA从感染者体内排出后经城市生活污水管道汇入城市污水处理厂,从城市生活污水处理厂入水口处采集生活污水并展开病毒检测分析,可获得该城市生活污水管网覆盖区域内人群中流行的NoV和RVA的分子流行病学特征。[目的]描述环境污水中NoV和RVA的时间分布,了解其基因型分布和动态变化,探索其遗传变异特征,为建立胃肠炎病毒的人群和环境综合监测系统提供依据。[方法]1.按照平原、山区、沿海不同地域特征,在山东省济南、临沂、烟台3个市设立生活污水监测点。于2017年1月至2018年6月使用定时采样法每月采集生活污水标本,在冷链条件下运输到实验室,采用阴离子膜吸附洗脱法进行浓缩。2.提取污水浓缩液的病毒核酸,采用NoV和RVA的特异性引物PCR扩增基因定型的靶基因,经过TA克隆后测序定型。3.使用BioEdit 7.2.5软件进行核苷酸与氨基酸序列同源性的比对,采用Mega 7.0软件进行系统发生学分析,使用邻位法(Neighbor-joining method)进行,Bootstrap分析重复1000次。[结果]1.NoV和RVA的检出情况本研究共收集2017年1月至2018年6月济南、烟台和临沂三地的未处理的生活污水54份。经RT-PCR检测分析,54份标本中NoV GⅠ基因型阳性标本数为53份,检出率为98.1%;NoV GⅡ基因型阳性标本数为52份,检出率为96.3%;RVA G基因型阳性标本数为52份,检出率为96.3%;RVA P基因型阳牲标本数为52份,检出率为96.3%。其中,济南和临沂两地收集的标本中NoVGⅠ基因型、NoVGⅡ基因型、RVAG基因型和RVAP基因型的检出率均为100%。2.NoV和RVA型别分布特征本研究共获得382条NoV Ⅰ序列,经NoV在线定型软件定型后得出该序列分别属于6个基因型,包括GⅠ.1、GⅠ.2、GⅠ.3、GⅠ.4、GⅠ.5和GⅠ.6。其中获得的序列数最多的两个基因型为GⅠ.6和GⅠ.5,分别占序列总数的40.3%(154/382)和39.8%(152/382)。获得282条NoV Ⅱ序列,分别属于6个基因型,包括GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.8、GⅡ.13和GⅡ.17。其中GⅡ.17为主要优势流行型别,其次为GⅡ.2和GⅡ.3,分别占序列总数的70.9%(200/282)、11.0%(31/282)和12.8%(36/282)。本研究获得305条RVA G序列,包括G1、G2、G3、G4、G6、G8和G9,其中G9检出数量最多,占RVAG基因型序列总数的86.9%(265/305),其余型别检出数量较少。获得410条RVA P序列,包括P[1]、P[3]、P[4]、P[8]、P[9]和P[14]。RVAP基因型中的优势流行型别为P[8]和P[4],分别占序列总数的48.3%(198/410)和45.1%(185/410),其余型别检出数量均较少。3.NoV和RVA同源性分析及优势型别系统发生学分析本研究对8个NoV和RVA基因型进行了序列分析。NoV GⅠ.5型内序列同源性较低,系统发生树显示其分为3个进化分支,GⅠ.6型内序列同源性较高且系统发生树显示其分为4个进化分支;NoV GⅡ.2型内序列同源性较高,系统发生树显示其分为3个进化分支,GⅡ.17型内序列同源性较低,获得的GⅡ.17在系统发生树上分为2个进化分支,大部分序列与Kawasaki 308变异株亲缘关系较近。获得的RVAG9型内序列同源性较低,系统发生树显示其分为2个进化分支;RVAP[4]和P[8]型内序列同源性较高,系统发生树显示有数条传播链在监测地区共循环。[结论]1.NoV和RVA在监测地区人群中处于较高的流行强度,且存在NoV GⅠ.5、GⅠ.6和GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.17及RVAG9和P[4]、P[8]多个常见基因型构成的多条传播链共循环。2.NoVGⅠ.5检出明显增多,有可能成为本地近期的优势基因型别。RVAP优势基因型出现与前一监测时期的前后交替,为形成新的变异株,可能与同期人群免疫水平变化相关。3.同地区同时间与不同地区不同时间的毒株序列的型内核苷酸同源性达到1100%,传播链在人群中存在时空与地域的持续性循环传播。