研究背景:根据WHO 2018年的统计数据,结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球第三大常见恶性肿瘤,在癌症相关死因方面位于第二位。在我国,随着经济发展和生活方式逐步西化,CRC发病率始终呈上升趋势。为应对这种健康威胁,我们仍需深入研究CRC的发生发展机制,寻找关键分子和调控通路,以更好的指导CRC的预防、诊断和治疗。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是指一类长度大于200个碱基且目前没有发现明显蛋白编码能力的RNA转录物。随着高通量全转录组测序(RNA-seq)的发展和普及,越来越多的lnc RNA被发现鉴定,对它们的研究也逐步深入。已发现CCAT1、CCAT2等lnc RNA分子在CRC的发生发展中发挥作用,对它们的研究补充着CRC发生发展的分子机制网络,而继续寻找新的与CRC发生发展相关的lnc RNA可以不断拓展我们对这个网络的认识。目前认为绝大多数CRC的发生发展跨度5-10年,具有经典的腺瘤-癌序列(adenoma-carcinoma sequence)过程。我们希望通过对结直肠腺瘤-癌序列连续样本(正常粘膜-腺瘤息肉-腺癌)的全转录组测序研究,发现CRC发生发展过程中重要的差异表达lnc RNA,并探索其在CRC发生发展中的功能作用,为CRC的临床诊治提供新分子、新机制。第一部分:长链非编码RNA CASC21在结直肠癌中的表达及临床意义目的:筛选结直肠腺瘤-癌序列过程中的差异表达lnc RNA并分析其临床意义。方法:(1)通过对结直肠腺瘤-癌序列样本(正常粘膜-腺瘤息肉-腺癌)的全转录组测序和生物信息学分析,寻找结直肠癌发生过程中持续变化的lnc RNA,确定研究对象。(2)利用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-q PCR),在临床CRC样本中验证所选择lnc RNA的差异表达情况。(3)利用TCGA数据验证所选择lnc RNA在结直肠腺癌组织及配对正常粘膜中的差异表达情况。(4)分析lnc RNA表达与临床病理特征之间的关系。(5)利用RT-q PCR检测所选lnc RNA在结肠癌细胞系及永生化正常肠粘膜细胞中的表达情况。(6)利用核质分离实验和RNA荧光原位杂交实验(RNA FISH)研究所选择lnc RNA的亚细胞定位情况。结果:(1)通过对4对结直肠腺瘤-癌序列样本的全转录组测序和生信分析,发现lnc RNA CASC21在腺瘤-癌序列过程中表达逐步升高,故选择lnc RNA CASC21进一步深入研究。(2)利用RT-q PCR对腺癌-正常组织样本进行检测,发现lnc RNA CASC21在腺癌组织中较正常粘膜表达升高,验证了测序结果。(3)利用TCGA中的结直肠癌数据进一步验证了lnc RNA CASC21在结直肠癌中表达升高。(4)分析组织样本中lnc RNA CASC21表达与临床病理特征的关系发现:lnc RNA CASC21表达与肿瘤大小相关,在肿瘤最大径≥5cm组较<5cm组表达升高,差异有统计学意义(p<0.05);lnc RNA CASC21的表达与肿瘤TNM分期相关,Ⅲ-Ⅳ期较Ⅰ-Ⅱ期表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。(5)RT-q PCR检测发现,在结肠癌细胞系(RKO、SW620、HCT116、SW116)中lnc RNA CASC21的表达均高于永生化的正常肠粘膜细胞FHC。(6)核质分离实验和RNA FISH实验显示lnc RNA CASC21同时定位于细胞核和细胞质。结论:lnc RNA CASC21在结直肠癌组织中表达明显升高,且表达与结直肠癌肿瘤大小、肿瘤的TNM分期相关,提示其可能在结直肠癌发生发展中发挥一定作用。亚细胞定位显示lnc RNA CASC21同时存在于细胞核和细胞质中。第二部分:长链非编码RNA CASC21表达对结肠癌细胞功能的影响目的:研究lnc RNA CASC21表达对结肠癌细胞功能表型的影响。方法:(1)利用si RNA敲减结肠癌细胞中lnc RNA CASC21的表达,利用过表达质粒升高结肠癌细胞中lnc RNA CASC21的表达,并分别RT-q PCR验证。(2)敲减或过表达结肠癌细胞中的lnc RNA CASC21,用CCK8法和Ed U掺入法检测细胞增殖能力的变化,用平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力的变化。(3)敲减或过表达结肠癌细胞中的lnc RNA CASC21,用Transwell小室实验检测结肠癌细胞迁移和侵袭能力的变化。(4)过表达结肠癌细胞中lnc RNA CASC21,用RT-q PCR法检测细胞EMT相关分子m RNA水平变化,western blot方法检测m RNA水平变化明显分子在蛋白水平的变化情况。(5)敲减结肠癌细胞中lnc RNA CASC21表达,用流式细胞仪检测细胞凋亡和周期变化情况。(6)过表达或敲减结肠癌细胞中lnc RNA CASC21进行裸鼠皮下荷瘤实验,研究lnc RNA CASC21在体内功能作用。结果:(1)4条CASC21 si RNA中CASC21-S1和CASC21-S2拥有最高的敲减效率,选择用于后续敲减实验,过表达质粒可以有效过表达lnc RNA CASC21。(2)CCK8细胞增殖实验和Ed U增殖实验中,敲减lnc RNA CASC21表达可以减弱结肠癌细胞的增殖能力,过表达lnc RNA CASC21可以增强结肠癌细胞的增殖能力;克隆形成实验中,敲减lnc RNA CASC21表达减弱结肠癌细胞克隆形成能力,过表达lnc RNA CASC21增强结肠癌细胞克隆形成能力。(3)Transwell小室实验中,敲减lnc RNA CASC21表达减弱结肠癌细胞的迁移侵袭能力,过表达lnc RNA CASC21增强结肠癌细胞的迁移侵袭能力。(4)过表达结肠癌细胞中lnc RNA CASC21可以引起EMT相关分子表达变化,其中上皮标志物E-cadherin在m RNA和蛋白水平表达均降低,间质标志物N-cadherin、Slug及Twist在m RNA和蛋白水平表达都升高。(5)流式细胞仪检测发现敲减结肠癌细胞中lnc RNA CASC21表达对细胞凋亡和细胞周期无显著影响。(6)裸鼠皮下荷瘤实验发现,过表达lnc RNA CASC21结肠癌细胞成瘤能力增强,敲减lnc RNA CASC21表达细胞成瘤能力减弱。结论:lnc RNA CASC21表达变化可以影响结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力及EMT过程,但对细胞凋亡、周期无显著影响。第三部分:长链非编码RNA CASC21在结直肠癌中作用机制研究目的:研究lnc RNA CASC21在结直肠癌中的分子作用机制。方法:(1)分析lnc RNA CASC21表达与c-Myc表达的相关性,在结肠癌细胞中敲减或过表达lnc RNA CASC21,检测c-Myc在m RNA和蛋白水平变化情况;转染质粒过表达c-Myc,检测lnc RNA CASC21表达变化情况。(2)利用程序预测lnc RNA CASC21可能结合的蛋白,RNA pulldown实验和RNA免疫沉淀实验进行验证。(3)利用染色质免疫沉淀实验(Ch IP-q PCR)研究lnc RNA CASC21表达对转录因子CTCF与c-Myc基因转录起始下游结合的影响;通过启动子双荧光素酶报告基因实验,检测lnc RNA CASC21和CTCF表达对c-Myc基因启动子区活性的影响。(4)利用程序预测可同时靶向lnc RNA CASC21和c-Myc的micro RNA,检测micro RNA在结肠癌细胞系及结直肠癌组织样本中的表达筛选micro RNA;检测分析lnc RNA CASC21与micro RNA的表达关系,通过双荧光素酶报告基因实验、anti-Ago2 RIP实验验证lnc RNA CASC21与micro RNA间的结合及作用;通过双荧光素酶报告基因实验验证c-Myc与micro RNA间的结合作用,通过anti-Ago2 RIP实验验证lnc RNA CASC21与c-Myc间存在ce RNA作用。(5)在结肠癌细胞中共转染CASC21 si RNA和c-Myc过表达质粒进行表型补救实验。结果:(1)TCGA数据中lnc RNA CASC21表达与c-Myc表达呈正相关(r=0.50,p<0.001),结直肠癌组织样本中lnc RNA CASC21表达与c-Myc表达亦呈正相关(r=0.56,p<0.001);结肠癌细胞中敲减或过表达lnc RNA CASC21可以分别下调或上调c-Myc的m RNA水平和蛋白水平;结肠癌细胞中升高c-Myc表达对lnc RNA CASC21的表达无显著影响。(2)通过cat RAPID和RPISeq预测lnc RNA CASC21可能与转录因子CTCF相结合,利用RNA pulldown实验和RIP实验验证CTCF与lnc RNA CASC21间的结合。(3)Ch IP-q PCR实验显示lnc RNA CASC21表达升高后CTCF与c-Myc基因转录起始下游结合减少;启动子双荧光素酶报告基因实验显示lnc RNA CASC21表达升高,荧光素酶活性升高;敲减lnc RNA CASC21表达可以减弱荧光素酶活性;过表达CTCF可以减弱荧光素酶活性。(4)通过程序预测发现mi R-1827可同时靶向lnc RNA CASC21和c-Myc,且其在结肠癌细胞系中表达均较永生化的正常肠粘膜细胞降低,在结直肠癌组织中的表达较正常肠粘膜组织降低,在结直肠癌组织中mi R-1827表达与lnc RNA CASC21表达呈负相关(r=-0.534,p<0.001);敲减结肠癌细胞中lnc RNA CASC21表达,mi R-1827表达升高,升高结肠癌细胞中mi R-1827表达,lnc RNA CASC21表达降低;双荧光素酶报告基因实验显示mi R-1827可通过预测序列与lnc RNA CASC21及c-Myc发生作用;anti-Ago2 RIP实验显示mi R-1827可与lnc RNA CASC21结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),过表达细胞中lnc RNA CASC21,RISC中lnc RNA CASC21升高,c-Myc减少,而敲减细胞中lnc RNA CASC21,RISC中lnc RNA CASC21减少,c-Myc升高。(5)表型补救实验显示lnc RNA CASC21通过c-Myc发挥促进结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用。结论:(1)细胞核中lnc RNA CASC21可以通过与CTCF结合,影响CTCF与c-Myc基因转录起始下游结合,从而解除CTCF对c-Myc的转录抑制,促进c-Myc转录表达。(2)细胞质中lnc RNA CASC21可以与c-Myc竞争性结合mi R-1827,从而解除mi R-1827对c-Myc表达的干扰,促进c-Myc表达。(3)lnc RNA CASC21通过在细胞核和细胞质中协同调控c-Myc表达发挥促进结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用。