猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae， APP)引起的高度接触传染性呼吸道疾病(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)，重创了全球畜牧业。　　胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子众多，各种毒力因子在APP致病过程中的角色及其相互作用的关系形成了错综复杂的网络。病原菌在感染过程中通过双组分调控系统(Two-Component Regulatory System, TCS)密切感受各种条件下因素的变化，从而调节多种基因的表达来适应新的宿主微环境以完成其致病过程。　　经全基因组序列分析发现胸膜肺炎放线杆菌血清3型JL03菌株存在五对TCSs，即arcA/arcB、cpxA/cpxR、narQ/narP、phoB/phoR、ygiY/ygiX。　　硝酸盐是很多细菌在厌氧生长条件下最偏爱的电子受体。narQ/narP是E.coli以及巴斯德科属的细菌感应硝酸盐信号的 TCS，与许多菌属的 narX/narL具有很高同源性，在许多病原菌中都存在这对双组分调控系统。在 E.coli中 narQ/narP与narX/narL具有相互调节作用。作为一种兼性厌氧菌，通过比较基因组分析发现，所有已测序的APP菌株中均无narX/narL存在。那么，narQ/narP是通过怎样的调控机制来影响APP的功能？　　鉴于上述背景，在本实验室已经完成的国内流行的APP血清3型JL03菌株全基因组测序基础上，以国内流行的强毒株APP血清1型SLW01菌株为亲本，开展了narQ/narP双组分调控系统可能的调控机制的研究。本研究首先使用两步交换同源重组的方法，利用 SacB蔗糖负向筛选结合氯霉素正向筛选作为标记基因构建了SLW01的narQ、narP单基因和narQ/narP双基因缺失突变株，研究narQ/narP敲除后细菌的遗传稳定性、生长特性、溶血性、外观形态、毒力等发生的变化，并运用表达谱芯片和荧光定量PCR，筛选突变株与亲本株的差异表达基因，分析narQ/narP可能参与调控的基因，为 APP致病机理的深入研究奠定前期基础，并为 APP毒力因子相互调控网络及药物靶标设计等提供理论基础。主要研究内容包括：　　1．JL03中narQ，narP生物信息学分析　　参照NCBI中APP血清3型JL03菌株生物学信息，对JL03中双组分调控系统narQ/narP在基因组上的位置，转录方向，碱基组成，G+C含量及保守性区域进行分析，绘制进化树。分析表明，双组分在基因组上的位置相距较远，二者转录方向相反，narP位于正链，narQ位于负链，二者在细菌种属进化中较为保守，与曼氏杆菌属相应蛋白的亲缘关系最近，二者分别符合HK和RR的一般结构特点。　　2．cnarP/cnarQ/cnarPQ基因缺失菌株的构建及鉴定　　从SLW01中扩增narP和narQDNA的上下游片段，将得到的上下游片段依次连接到重组转移质粒pEMOC2，构建重组转移质粒pEMcnarP和重组转移质粒pEMcnarQ。　　cnarP的构建是以转化了重组转移质粒pEMcnarP的E.coliβ2155为供体菌，APP血清1型菌株SLW01为受体菌进行接合转移，采用基于SacB蔗糖负向筛选结合两步交换同源重组的方法构建的。同样，cnarQ是以转化了重组转移质粒 pEMcnarQ的E.coliβ2155为供体菌，APP血清1型菌株SLW01为受体菌采取同样的接合转移的方法进行。在cnarP的基础上，用转化了质粒pEMcnarQ的E.coliβ2155作为供体菌，cnarP作为受体菌进行接合转移，用同样的方法构建了双基因缺失株cnarPQ。通过序列分析，发现目的基因已经缺失；RT-PCR结果显示，突变株中无目的基因转录信号。结果表明缺失株构建成功。　　3.cnarP/cnarQ互补菌株（CnarP, CnarQ)的构建及鉴定　　从SLW01基因组中扩增narP，narQ的DNA，将其连接入E.coli—胸膜肺炎穿梭质粒pJFF-XN构建重组表达质粒pJFF-narP， pJFF-narQ，将质粒分别电转化入SLW01菌株中，获得cnarP、cnarQ的互补菌株（CnarP, CnarQ)，使用RT-PCR对其进行验证。结果表明互补菌株构建成功。　　4．反应调控蛋白narP的表达　　扩增SLW01中narP基因，将其连接入原核表达载体pET-28a构建原核表达质粒 pET-narp。将质粒转化入 E.coli（BL21）后用 IPTG对其诱导表达，SDS-PAGE检测其表达活性。结果IPTG诱导6小时，获得E.coli重组narP蛋白。narP可以稳定表达。　　5．基因缺失菌株生物学特性的研究　　将cnarP、cnarQ、cnarPQ缺失菌株分别在平皿上连续传20代，每代都使用PCR鉴定其遗传稳定性，结果表明，三种缺失株都能够稳定的遗传；将缺失株与亲本株的单菌落接种于9％绵羊血平皿培养23h测定cnarP、cnarQ和cnarQ的溶血活性，结果显示溶血活性无显著差异；对缺失株和亲本株的生长速率进行比较，绘制cnarP、cnarQ和cnarPQ生长曲线，分析表明cnarP、cnarQ和cnarPQ与亲本菌比较，在对数生长期缺失株比亲本株生长稍慢；将缺失株和亲本株在TSA平皿培养7h经固定液固定，用扫描电镜观察其外观形态有无变化，结果表明外观形态无明显差异。本研究测定了APP亲本菌和cnarP缺失菌对Balb/C小鼠的LD50，结果显示，与亲本菌SLW01比较，cnarP的毒力有所降低，其互补株CnarP与亲本株相比毒力稍有所升高。　　6．缺失株与亲本株差异表达基因的筛选和功能聚类分析　　将SLW01、cnarP、cnarQ和cnarPQ同时分别在有氧和厌氧条件下培养，利用APP表达谱芯片分析菌株对数期的转录谱，对芯片杂交的原始数据统计分析，找出了缺失株与亲本株有明显差异表达的一些基因。使用荧光定量PCR验证芯片结果的可靠性。进一步对一些基因进行了功能及聚类分析。　　有氧条件下与SLW01相比，cnarP差异表达基因有75个，而cnarQ差异表达的基因有31个，以及cnarPQ有21个。　　厌氧条件下条件与SLW01相比，cnarPQ双基因缺失突变株差异表达基因达84个，cnarQ有61个，cnarP有22个SLW01在厌氧与有氧培养条件下相比，总有153个基因在转录水平上出现了明显变化。有41个基因上调表达，有112个基因下调表达。