急性髓细胞白血病（Acute Myelocytic Leukemia，AML）是造血系统的恶性侵袭性疾病，尽管诱导化疗能使70％以上的患者获得临床缓解，但大部分之后复发，AML患者长期存活率只在40％左右，更有效的治疗策略急待开发。FMS样酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine kinase 3，FLT3）是Ⅲ型受体酪氨酸激酶（RTK）受体家族的成员，在骨髓中主要表达在CD34⁺的造血干／祖细胞及树突状前体细胞上，配体介导的FLT3活化在造血原始细胞的增殖、分化中有重要的作用。然而超过70％的AML细胞表面表达有野生型FLT3、25～35％的表达有突变型FLT3，包括30％左右的FL73近膜结构域短串联重复突变（FLT3-ITD）和7％的酪氨酸激活结构域点突变（FLT3-TDK）。FLT3异常表达和患者的临床白细胞增多症、预后差密切相关。FLT3作为AML治疗极有前景的分子靶标深受关注。目前已开发了几种FLT3抑制剂，但Ⅰ、Ⅱ期临床实验的结果不令人满意。首先没有一种抑制剂是真正FLT3特异性的，它们也可识别VEGF、c-KIT、FMS及PDGF等受体，临床毒副作用不可避免；另外FLT3-TDK各种点突变引发FLT3结构的细微变化，也导致了某些FLT3抑制剂的耐药问题。更重要的是AML的发病具多基因突变累加的特点，相关基因的研究远未完善；研究证实FLT3信号传导涉及许多中介分子，但大多数在此信号级联中的地位和作用还不清楚，进一步阐明FLT3与其它分子相互作用的机制，FLT3异常激活引发的下游信号途径，将为FLT3靶向治疗研究提供新的视野。RNA干扰是FLT3靶向抑制的另一策略，它不仅为FLT3功能学研究提供了强有力的工具，也是AML极有前景的基因治疗手段。本研究中首先设计、合成了3条FLT3靶向的短发夹状干扰RNA（FL73-shRNA），通过转染FLT3过表达的AML细胞株，评价其抑制效应，筛选出效率高的1条；随后体外实验中探讨了FLT3表达的下调对THP-1、HL-60细胞增殖，凋亡的作用。目前对FLT3信号传导的研究，野生型主要集中在PI3K-AKT、RAS-MAPK、SRC通路上，ITD突变型还包括STAT5通路，对在AML发生、发展中有重要作用的核因子κ-B（Nuclear Factor Kappa B，NF-κB）通路、辅抑制子维甲酸／甲状腺受体沉默因子（Silencing Medtiator for Retinoic Acid and Thyroid Hormone Receptor，SMRT），研究还少有涉及。NF-κB是一类核内转录因子，它通过调节cyclinD1，c-myc，Bcl-2等基因的转录，可正性调节细胞增殖、凋亡等过程；SMRT是真核生物基因转录抑制调节的基本成分，因此作者通过RNA干扰的方法下调FLT3表达，探讨NF-κB通路、SMRT在FLT3信号传递中的可能作用。并通过建立THP-1白血病细胞Nu／Nu皮下移植瘤模型，体内实验观察FLT3-shRNA干扰单独，或与NF-κB抑制剂Parthenolide（PN）、柔红霉素（Daunorubicin，DNR）联合作用时的抗白血病效应。第一部分五种髓细胞白血病细胞株FLT3表达及FLT3-ITD突变的研究方法1．对5种髓细胞白血病细胞株THP-1、HL-60、K562、Dami及Meg-01，以RT-PCR法检测细胞FLT3 mRNA的表达。2．FLT3在细胞中有胞浆蛋白和跨膜蛋白两种存在形式，FLT3跨膜蛋白是其活性形式。以Western blotting检测FLT3总蛋白的表达，以流式细胞术（FCM）法检测FLT3跨膜蛋白的表达。3．鉴于FLT3-ITD突变型与其它类型的FLT3受体激活方式、信号传导途径都有不同，提取各细胞基因组DNA，PCR扩增其易发生I7D突变的近膜区序列，PCR产物连入T-载体并测序，检测是否存在FLT3-I7D突变。结果1．5种细胞株中，只有THP-1、HL-60细胞中测及FLT3 mRNA的表达，相对于自身GAPDH mRNA的含量分别是0.83±0.07、0.48±0.05。2．Western blotting结果显示THP-1、HL-60细胞中有FLT3蛋白的表达，FCM显示FLT3跨膜蛋白在于HP-1、HL-60细胞的表达率分别是53.55±4.44％、27.57±3.42％，前者属强阳性表达、后者属中阳性表达。3．核酸测序结果显示THP-1、HL-60细胞中扩得的JM区基因片段均为329bp，与野生型FLT3的长度同；经与基因库FLT3序列比对同源性达98％以上，提示均不存在FLT3-ITD突变。第二部分FT73靶向短发夹状干扰RNA体外转录合成、筛选及作用方法1．设计、体外转录合成3条FLT3-shRNA、1条阴性对照shRNA（NC-shRNA），确定其浓度。2．用25nM的3种FLT3-shRNA、NC-shRNA转染THP-1细胞，24h、48h及72h分别收获细胞，RT-PCR法检测各组FLT3 mRNA的表达，以GAPDH作内参计算其mRNA的相对含量，初步确定各shRNA的干扰效率。3．将对mRNA抑制效率较高的FLT3-shRNA1，以5nM、10nM、15nM、20nM、25nM浓度转染THP-1细胞，48h收获细胞测FLT3 mRNA，评价浓度效应关系。4．将对mRNA抑制效率达50％以上的FLT3-shRNA1、shRNA3转染THP-1细胞，48h、72h收获细胞，以FCM测FLT3跨膜蛋白的表达，72h以Western blotting测FLT3总蛋白的表达。5．根据上述结果，用15nM的FLT3-shRNA1转染HL-60细胞，48h以RT-PCR测FLT3 mRNA表达，72h以FCM、Western blotting测FLT3蛋白的表达。结果1．成功合成3条FLT3-shRNA、1条NC-shRNA。2.25nM的NC-shRNA对FLT3 mRNA表达无影响，所设计的shRNA中，FLT3-shRNA1、shRNA3对其mRNA抑制率超过50％，shRNA1的抑制率强于shRNA3的（p＜0.001）；shRNA1作用最强时间是48h，抑制率是72.95±2.07％；shRNA3是72h，抑制率是54.95±2.07％。3．在5nM～15nM范围内FLT3-shRNA1对其mRNA抑制率随浓度增加而增大，15nM转染48h抑制率是71.60±1.46％；20nM、25nM的与15nM无差异（P＞0.05）。4.15nM的NC-shRNA对FLT3跨膜蛋白的细胞表达率无影响。FLT3-shRNA1、shRNA3转染48h、72h，表达率均有明显下降，shRNA1作用强于shRNA3的，72h强于48h的（均P＜0.001）；shRNA1作用72h对FLT3跨膜蛋白的抑制率是79.67±0.66％。Western blotting结果也支持shRNA1转染72h对FLT3蛋白的抑制作用更强。5．15nM的FLT3-shRNA1转染HL-60细胞，48h对FLT3 mRNA的抑制率达（81.66±10.25）％。FCM测72h对FLT3跨膜蛋白的抑制率达（76.76±11.23）％，Western blotting结果也证实72h蛋白表达被明显抑制。第三部分FLT3靶向RNA干扰抑制THP-1、HL-60细胞增殖、促进凋亡的实验研究方法以下试验均设PBS对照组FLT3-shRNAi组，NC-shRNA组及，分别转染以15nM的FLT3-shRNA1、NC-shRNA，或处理以同体积数的PBS。1．96孔板中THP-1、HL-60细胞以4×10⁴／ml密度转染FLT3-shRNAl，培养8天，每天取3孔加入CCK-8，测定细胞增殖活力并绘制增殖曲线。细胞再以4×10⁵／ml密度转染，24h、48h、72h测定增殖活力并计算增殖抑制率。2．如上述处理细胞，48h各组细胞经PI染色，用FCM法测定细胞周期分布。3．转染48h分别以Annexin V-FITC法、DNA Ladder法检测THP-1、HL-60细胞凋亡状况，另THP-1细胞以TUNEL原位酶标记法检测凋亡。4．转染48h和72h，用RT-PCR法检测cyclin D1、cyclinA的mRNA表达；提取细胞总蛋白，用Western blotting检测其蛋白表达。结果1．与PBS对照相比，NC-shRNA转染THP-1、HL-60后细胞增殖曲线变化不大，但FLT3-shRNA转染后，两细胞增殖曲线均明显低平，缺乏指数增殖特征。转染指数增殖期的细胞后，细胞增殖活力明显下降，在THP-1抑制率是36.66±3.67％、在HL-60是33.10±3.43％。2．FLT3-shRNA1转染THP-1、HL-60细胞48h，细胞周期都出现G₀／G₁期细胞比例的增加（P＜0.01），S期细胞比例的下降（P＜0.05），即出现了G₀／G₁期至S期的阻滞。3．FLT3-shRNA1转染48h，Annexin V-FITC检测THP-1、HL-60细胞的早期凋亡率都有明显增加（P＜0.05），两细胞株上都检到了凋亡细胞典型的梯状条带（DNA Ladder）；通过TUNEL细胞原位杂交观察到THP-1晚期凋亡细胞比例的明显增加（P＜0.001）。4．由FLT3-shRNA1诱导FLT3表达的下调，可导致THP-1、HL-60细胞cyclin D1表达的下降，与NC-shRNA组比有显著差异（P＜0.01），48h对其mRNA的作用较大，在两细胞抑制率分别是37.09±3.76％、63.69±21.26％；Western blotting结果示48h有cyclin D1蛋白表达的下调，但72h更为明显。另外cyclin A的mRNA、蛋白表达在这一过程中无变化。第四部分NF-κB通路、核辅抑制子SMRT在FLT3信号传递中的作用方法1．THP-1细胞株中用RT-PCR检测NF-κB家族的P65、阻遏物IκB mRNA的表达，用免疫组化、Western blotting法检测其蛋白的表达。2．96孔板中用0μM～20nM范围内的系列浓度的NF-κB抑制剂Parthenolide（PN），处理4×10⁵／ml密度的THP-1细胞，12h、24h用CCK-8法检测细胞增殖活力，计算细胞增殖半数抑制浓度(IC₅₀)。后根据上述结果，用6μM的PN作用于4×10⁴／ml密度的THP-1细胞，共培养6天，绘制细胞增殖曲线。3．试验共分5组，分别处理以PBS、NC-shRNA、FLT3-shRNAi、PN及FLT3-shRNAi＋PN，转染组均转以15nM的shRNA，作用终时间48h；PN组处理以6μM的PN，作用终时间24h。各组细胞收获后，用RT-PCR检测P65、IκB、cyclinD1及SMRTmRNA的表达；用Western blotting检测细胞总蛋白、核蛋白的表达。4．FLT3-shRNA1转染细胞48h，分别处理以系列浓度的PN，12h、24h用CCK-8法检测细胞增殖活力，计算IC₅₀。5．THP-1细胞分别处理以PBS、FLT3-shRNAi、PN及FLT3-shRNAi＋PN，细胞收获后以FCM检测细胞周期分布，以Annexin V-FITC法检测细胞凋亡。结果1．RT-PCR结果显示THP-1细胞有P65、IκB的mRNA表达，免疫组化示P65、IκB蛋白均主要表达在胞浆内；Western blotting示P65在胞浆、胞核均有表达，而IκB在核内没有表达。2．PN对THP-1细胞增殖有抑制作用，存在着剂量．效应关系。6μM的PN处理后细胞的增殖曲线明显低平。PN作用后细胞IκB表达明显增加，P65的mRNA、总细胞蛋白表达没有变化，核蛋白明显下降，cyclin D1也有下降；在这一过程中SMRT mRNA、总细胞蛋白表达没有变化，但核蛋白明显上调。3．FLT3-shRNA1转染THP-1细胞48h，P65、IκB的mRNA、总细胞蛋白表达水平没有变化，P65核蛋白的表达下降，cyclin D1表达也随之下降。SMRT mRNA、总细胞蛋白表达也没有变化，但核蛋白表达有明显的上调。4．FLT3-shRNA1下调FLT3表达后，THP-1细胞对PN的敏感性增加，12h对PN的IC₅₀在6μM～8μM，24h的IC₅₀在4μM～6μM，与PBS处理对照相比均有下降。再者FLT3-shRNAi、PN联合作用后，比其单独作用时细胞周期中G₀／G₁期细胞比例更高（P＜0.05），S期也更低（P＜0.05）；Annexin V测细胞早期凋亡率更高（P＜0.05）。分子水平检测显示P65核蛋白在联合组表达量低于PN组，更低于FLT3-shRNAi组；联合组IκB表达的上升与PN组无差异；联合组cyclinD1表达也有更明显的下降。第五部分Nu／Nu裸鼠移植瘤模型建立及FLT3靶向RNA干扰体内抗白血病的效应方法1．指数生长期的THP-1细胞，以1×10⁷／只剂量接种到Nu／Nu裸鼠右腋皮下，建立THP-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型。2．当THP-1移植瘤体积长到100～300mm³，随机分6组，5只／组，各组按既定方案腹腔注射给药，分别处理以PBS（1组）、FLT3-shRNAi（2组）、PN（3组）、shRNAi＋PN（4组）、柔红霉素（DNR，5组）、shRNAi＋DNR（6组），总计15天。3．隔日测瘤体积，裸鼠体重；实验结束时处死小鼠称瘤重，计算抑瘤率。4．对取出的瘤组织，用TUNEL检测瘤细胞凋亡，用免疫组化、RT-PCR、Westernblotting分别检测FLT3、P65、IκB、cyclin D1、SMRT的表达。结果1．成功建立了THP-1细胞Nu／Nu裸鼠移植瘤模型，成瘤率为94.44％。2．腹腔注射FLT3-shRNAi，裸鼠THP-1移植瘤生长受到抑制，其抑制率为28.95％。瘤组织中FLT3的表达明显下降，TUNEL测瘤组织中凋亡细胞比例增加（P＜0.05）；Western blotting显示瘤组织P65核蛋白表达下降，cyclin D1下降，胞核内SMRT表达上升。3．腹腔注射PN后裸鼠THP-1移植瘤生长受到抑制，其抑制率为32.46％，瘤组织IκB表达上调，胞核内p65表达下降，cyclin D1也下降，胞核内SMRT表达上升。注射FLT3-shRNAi＋PN的裸鼠移植瘤生长被抑制得更为明显，抑瘤率达49.12％（P＜0.05），瘤组织中凋亡细胞比例上升得更多（P＜0.01），胞核内p65下降更明显，cyclin D1下降也更明显，但SMRT的上升并不比PN单独治疗组的更高。4．腹腔注射DNR对裸鼠THP-1移植瘤的抑制率达71.93％，注射FLT3-shRNAi＋DNR的为82.46％。结论1．5种髓系白血病细胞株THP-1、HL-60、K562、Dami及Meg-01中，只有THP-1、HL-60有FLT3受体的持续表达，它们都不存有FLT3-ITD突变。2．所设计、体外转录合成的FLT3-shRNA1，在THP-1、HL-60细胞中可有效地抑制FLT3表达。3．用FLT3-shRNA1特异性地下调FLT3表达后，可抑制THP-1、HL-60细胞增殖，促进凋亡，体外实验初步证实具有抗白血病的作用。cyclin D1表达下调，细胞周期出现G₀／G₁期到S期的阻滞，是FLT3表达下调后AML细胞增殖抑制的原因之一。4．THP-1细胞中有NF-κB信号通路的持续激活，NF-κB抑制剂PN可通过增加IκB表达，阻逆P65的核转运，有效地抑制NF-κB信号传递，从而对细胞的增殖起抑制作用。5．FLT3下调可通过诱导P65核蛋白表达下降，下调NF-κB通路活性，从而抑制细胞增殖。SMRT也是介导FLT3信号传递的重要因子，FLT3-shRNAi可通过增加SMRT的核内表达，增强其转录抑制作用。6．FLT3-shRNAi可增强THP-1细胞对PN的药物敏感性，FLT3-shRNAi与PN联合作用可通过更强地抑制NF-κB信号通路，体外实验证实有更好的抗白血病效应。7．裸鼠腹腔注射FLT3-shRNA1可通过下调FLT3表达，PN可通过抑制NF-κB活性，对THP-1细胞移植瘤组织有轻、中度的抑制作用，当二者联用时效果更为显著；FLT3-shRNA1与DNR联用时可增加DNR的抑瘤效果，体内实验证实FLT3靶向RNA干扰具有抗白血病作用。