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急性髓细胞白血病(Acute Myelocytic Leukemia,AML)是造血系统的恶性侵袭性疾病,尽管诱导化疗能使70%以上的患者获得临床缓解,但大部分之后复发,AML患者长期存活率只在40%左右,更有效的治疗策略急待开发。FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3,FLT3)是Ⅲ型受体酪氨酸激酶(RTK)受体家族的成员,在骨髓中主要表达在CD34+的造血干/祖细胞及树突状前体细胞上,配体介导的FLT3活化在造血原始细胞的增殖、分化中有重要的作用。然而超过70%的AML细胞表面表达有野生型FLT3、25~35%的表达有突变型FLT3,包括30%左右的FL73近膜结构域短串联重复突变(FLT3-ITD)和7%的酪氨酸激活结构域点突变(FLT3-TDK)。FLT3异常表达和患者的临床白细胞增多症、预后差密切相关。FLT3作为AML治疗极有前景的分子靶标深受关注。目前已开发了几种FLT3抑制剂,但Ⅰ、Ⅱ期临床实验的结果不令人满意。首先没有一种抑制剂是真正FLT3特异性的,它们也可识别VEGF、c-KIT、FMS及PDGF等受体,临床毒副作用不可避免;另外FLT3-TDK各种点突变引发FLT3结构的细微变化,也导致了某些FLT3抑制剂的耐药问题。更重要的是AML的发病具多基因突变累加的特点,相关基因的研究远未完善;研究证实FLT3信号传导涉及许多中介分子,但大多数在此信号级联中的地位和作用还不清楚,进一步阐明FLT3与其它分子相互作用的机制,FLT3异常激活引发的下游信号途径,将为FLT3靶向治疗研究提供新的视野。RNA干扰是FLT3靶向抑制的另一策略,它不仅为FLT3功能学研究提供了强有力的工具,也是AML极有前景的基因治疗手段。本研究中首先设计、合成了3条FLT3靶向的短发夹状干扰RNA(FL73-shRNA),通过转染FLT3过表达的AML细胞株,评价其抑制效应,筛选出效率高的1条;随后体外实验中探讨了FLT3表达的下调对THP-1、HL-60细胞增殖,凋亡的作用。目前对FLT3信号传导的研究,野生型主要集中在PI3K-AKT、RAS-MAPK、SRC通路上,ITD突变型还包括STAT5通路,对在AML发生、发展中有重要作用的核因子κ-B(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)通路、辅抑制子维甲酸/甲状腺受体沉默因子(Silencing Medtiator for Retinoic Acid and Thyroid Hormone Receptor,SMRT),研究还少有涉及。NF-κB是一类核内转录因子,它通过调节cyclinD1,c-myc,Bcl-2等基因的转录,可正性调节细胞增殖、凋亡等过程;SMRT是真核生物基因转录抑制调节的基本成分,因此作者通过RNA干扰的方法下调FLT3表达,探讨NF-κB通路、SMRT在FLT3信号传递中的可能作用。并通过建立THP-1白血病细胞Nu/Nu皮下移植瘤模型,体内实验观察FLT3-shRNA干扰单独,或与NF-κB抑制剂Parthenolide(PN)、柔红霉素(Daunorubicin,DNR)联合作用时的抗白血病效应。第一部分五种髓细胞白血病细胞株FLT3表达及FLT3-ITD突变的研究方法1.对5种髓细胞白血病细胞株THP-1、HL-60、K562、Dami及Meg-01,以RT-PCR法检测细胞FLT3 mRNA的表达。2.FLT3在细胞中有胞浆蛋白和跨膜蛋白两种存在形式,FLT3跨膜蛋白是其活性形式。以Western blotting检测FLT3总蛋白的表达,以流式细胞术(FCM)法检测FLT3跨膜蛋白的表达。3.鉴于FLT3-ITD突变型与其它类型的FLT3受体激活方式、信号传导途径都有不同,提取各细胞基因组DNA,PCR扩增其易发生I7D突变的近膜区序列,PCR产物连入T-载体并测序,检测是否存在FLT3-I7D突变。结果1.5种细胞株中,只有THP-1、HL-60细胞中测及FLT3 mRNA的表达,相对于自身GAPDH mRNA的含量分别是0.83±0.07、0.48±0.05。2.Western blotting结果显示THP-1、HL-60细胞中有FLT3蛋白的表达,FCM显示FLT3跨膜蛋白在于HP-1、HL-60细胞的表达率分别是53.55±4.44%、27.57±3.42%,前者属强阳性表达、后者属中阳性表达。3.核酸测序结果显示THP-1、HL-60细胞中扩得的JM区基因片段均为329bp,与野生型FLT3的长度同;经与基因库FLT3序列比对同源性达98%以上,提示均不存在FLT3-ITD突变。第二部分FT73靶向短发夹状干扰RNA体外转录合成、筛选及作用方法1.设计、体外转录合成3条FLT3-shRNA、1条阴性对照shRNA(NC-shRNA),确定其浓度。2.用25nM的3种FLT3-shRNA、NC-shRNA转染THP-1细胞,24h、48h及72h分别收获细胞,RT-PCR法检测各组FLT3 mRNA的表达,以GAPDH作内参计算其mRNA的相对含量,初步确定各shRNA的干扰效率。3.将对mRNA抑制效率较高的FLT3-shRNA1,以5nM、10nM、15nM、20nM、25nM浓度转染THP-1细胞,48h收获细胞测FLT3 mRNA,评价浓度效应关系。4.将对mRNA抑制效率达50%以上的FLT3-shRNA1、shRNA3转染THP-1细胞,48h、72h收获细胞,以FCM测FLT3跨膜蛋白的表达,72h以Western blotting测FLT3总蛋白的表达。5.根据上述结果,用15nM的FLT3-shRNA1转染HL-60细胞,48h以RT-PCR测FLT3 mRNA表达,72h以FCM、Western blotting测FLT3蛋白的表达。结果1.成功合成3条FLT3-shRNA、1条NC-shRNA。2.25nM的NC-shRNA对FLT3 mRNA表达无影响,所设计的shRNA中,FLT3-shRNA1、shRNA3对其mRNA抑制率超过50%,shRNA1的抑制率强于shRNA3的(p<0.001);shRNA1作用最强时间是48h,抑制率是72.95±2.07%;shRNA3是72h,抑制率是54.95±2.07%。3.在5nM~15nM范围内FLT3-shRNA1对其mRNA抑制率随浓度增加而增大,15nM转染48h抑制率是71.60±1.46%;20nM、25nM的与15nM无差异(P>0.05)。4.15nM的NC-shRNA对FLT3跨膜蛋白的细胞表达率无影响。FLT3-shRNA1、shRNA3转染48h、72h,表达率均有明显下降,shRNA1作用强于shRNA3的,72h强于48h的(均P<0.001);shRNA1作用72h对FLT3跨膜蛋白的抑制率是79.67±0.66%。Western blotting结果也支持shRNA1转染72h对FLT3蛋白的抑制作用更强。5.15nM的FLT3-shRNA1转染HL-60细胞,48h对FLT3 mRNA的抑制率达(81.66±10.25)%。FCM测72h对FLT3跨膜蛋白的抑制率达(76.76±11.23)%,Western blotting结果也证实72h蛋白表达被明显抑制。第三部分FLT3靶向RNA干扰抑制THP-1、HL-60细胞增殖、促进凋亡的实验研究方法以下试验均设PBS对照组FLT3-shRNAi组,NC-shRNA组及,分别转染以15nM的FLT3-shRNA1、NC-shRNA,或处理以同体积数的PBS。1.96孔板中THP-1、HL-60细胞以4×104/ml密度转染FLT3-shRNAl,培养8天,每天取3孔加入CCK-8,测定细胞增殖活力并绘制增殖曲线。细胞再以4×105/ml密度转染,24h、48h、72h测定增殖活力并计算增殖抑制率。2.如上述处理细胞,48h各组细胞经PI染色,用FCM法测定细胞周期分布。3.转染48h分别以Annexin V-FITC法、DNA Ladder法检测THP-1、HL-60细胞凋亡状况,另THP-1细胞以TUNEL原位酶标记法检测凋亡。4.转染48h和72h,用RT-PCR法检测cyclin D1、cyclinA的mRNA表达;提取细胞总蛋白,用Western blotting检测其蛋白表达。结果1.与PBS对照相比,NC-shRNA转染THP-1、HL-60后细胞增殖曲线变化不大,但FLT3-shRNA转染后,两细胞增殖曲线均明显低平,缺乏指数增殖特征。转染指数增殖期的细胞后,细胞增殖活力明显下降,在THP-1抑制率是36.66±3.67%、在HL-60是33.10±3.43%。2.FLT3-shRNA1转染THP-1、HL-60细胞48h,细胞周期都出现G0/G1期细胞比例的增加(P<0.01),S期细胞比例的下降(P<0.05),即出现了G0/G1期至S期的阻滞。3.FLT3-shRNA1转染48h,Annexin V-FITC检测THP-1、HL-60细胞的早期凋亡率都有明显增加(P<0.05),两细胞株上都检到了凋亡细胞典型的梯状条带(DNA Ladder);通过TUNEL细胞原位杂交观察到THP-1晚期凋亡细胞比例的明显增加(P<0.001)。4.由FLT3-shRNA1诱导FLT3表达的下调,可导致THP-1、HL-60细胞cyclin D1表达的下降,与NC-shRNA组比有显著差异(P<0.01),48h对其mRNA的作用较大,在两细胞抑制率分别是37.09±3.76%、63.69±21.26%;Western blotting结果示48h有cyclin D1蛋白表达的下调,但72h更为明显。另外cyclin A的mRNA、蛋白表达在这一过程中无变化。第四部分NF-κB通路、核辅抑制子SMRT在FLT3信号传递中的作用方法1.THP-1细胞株中用RT-PCR检测NF-κB家族的P65、阻遏物IκB mRNA的表达,用免疫组化、Western blotting法检测其蛋白的表达。2.96孔板中用0μM~20nM范围内的系列浓度的NF-κB抑制剂Parthenolide(PN),处理4×105/ml密度的THP-1细胞,12h、24h用CCK-8法检测细胞增殖活力,计算细胞增殖半数抑制浓度(IC50)。后根据上述结果,用6μM的PN作用于4×104/ml密度的THP-1细胞,共培养6天,绘制细胞增殖曲线。3.试验共分5组,分别处理以PBS、NC-shRNA、FLT3-shRNAi、PN及FLT3-shRNAi+PN,转染组均转以15nM的shRNA,作用终时间48h;PN组处理以6μM的PN,作用终时间24h。各组细胞收获后,用RT-PCR检测P65、IκB、cyclinD1及SMRTmRNA的表达;用Western blotting检测细胞总蛋白、核蛋白的表达。4.FLT3-shRNA1转染细胞48h,分别处理以系列浓度的PN,12h、24h用CCK-8法检测细胞增殖活力,计算IC50。5.THP-1细胞分别处理以PBS、FLT3-shRNAi、PN及FLT3-shRNAi+PN,细胞收获后以FCM检测细胞周期分布,以Annexin V-FITC法检测细胞凋亡。结果1.RT-PCR结果显示THP-1细胞有P65、IκB的mRNA表达,免疫组化示P65、IκB蛋白均主要表达在胞浆内;Western blotting示P65在胞浆、胞核均有表达,而IκB在核内没有表达。2.PN对THP-1细胞增殖有抑制作用,存在着剂量.效应关系。6μM的PN处理后细胞的增殖曲线明显低平。PN作用后细胞IκB表达明显增加,P65的mRNA、总细胞蛋白表达没有变化,核蛋白明显下降,cyclin D1也有下降;在这一过程中SMRT mRNA、总细胞蛋白表达没有变化,但核蛋白明显上调。3.FLT3-shRNA1转染THP-1细胞48h,P65、IκB的mRNA、总细胞蛋白表达水平没有变化,P65核蛋白的表达下降,cyclin D1表达也随之下降。SMRT mRNA、总细胞蛋白表达也没有变化,但核蛋白表达有明显的上调。4.FLT3-shRNA1下调FLT3表达后,THP-1细胞对PN的敏感性增加,12h对PN的IC50在6μM~8μM,24h的IC50在4μM~6μM,与PBS处理对照相比均有下降。再者FLT3-shRNAi、PN联合作用后,比其单独作用时细胞周期中G0/G1期细胞比例更高(P<0.05),S期也更低(P<0.05);Annexin V测细胞早期凋亡率更高(P<0.05)。分子水平检测显示P65核蛋白在联合组表达量低于PN组,更低于FLT3-shRNAi组;联合组IκB表达的上升与PN组无差异;联合组cyclinD1表达也有更明显的下降。第五部分Nu/Nu裸鼠移植瘤模型建立及FLT3靶向RNA干扰体内抗白血病的效应方法1.指数生长期的THP-1细胞,以1×107/只剂量接种到Nu/Nu裸鼠右腋皮下,建立THP-1细胞裸鼠皮下移植瘤模型。2.当THP-1移植瘤体积长到100~300mm3,随机分6组,5只/组,各组按既定方案腹腔注射给药,分别处理以PBS(1组)、FLT3-shRNAi(2组)、PN(3组)、shRNAi+PN(4组)、柔红霉素(DNR,5组)、shRNAi+DNR(6组),总计15天。3.隔日测瘤体积,裸鼠体重;实验结束时处死小鼠称瘤重,计算抑瘤率。4.对取出的瘤组织,用TUNEL检测瘤细胞凋亡,用免疫组化、RT-PCR、Westernblotting分别检测FLT3、P65、IκB、cyclin D1、SMRT的表达。结果1.成功建立了THP-1细胞Nu/Nu裸鼠移植瘤模型,成瘤率为94.44%。2.腹腔注射FLT3-shRNAi,裸鼠THP-1移植瘤生长受到抑制,其抑制率为28.95%。瘤组织中FLT3的表达明显下降,TUNEL测瘤组织中凋亡细胞比例增加(P<0.05);Western blotting显示瘤组织P65核蛋白表达下降,cyclin D1下降,胞核内SMRT表达上升。3.腹腔注射PN后裸鼠THP-1移植瘤生长受到抑制,其抑制率为32.46%,瘤组织IκB表达上调,胞核内p65表达下降,cyclin D1也下降,胞核内SMRT表达上升。注射FLT3-shRNAi+PN的裸鼠移植瘤生长被抑制得更为明显,抑瘤率达49.12%(P<0.05),瘤组织中凋亡细胞比例上升得更多(P<0.01),胞核内p65下降更明显,cyclin D1下降也更明显,但SMRT的上升并不比PN单独治疗组的更高。4.腹腔注射DNR对裸鼠THP-1移植瘤的抑制率达71.93%,注射FLT3-shRNAi+DNR的为82.46%。结论1.5种髓系白血病细胞株THP-1、HL-60、K562、Dami及Meg-01中,只有THP-1、HL-60有FLT3受体的持续表达,它们都不存有FLT3-ITD突变。2.所设计、体外转录合成的FLT3-shRNA1,在THP-1、HL-60细胞中可有效地抑制FLT3表达。3.用FLT3-shRNA1特异性地下调FLT3表达后,可抑制THP-1、HL-60细胞增殖,促进凋亡,体外实验初步证实具有抗白血病的作用。cyclin D1表达下调,细胞周期出现G0/G1期到S期的阻滞,是FLT3表达下调后AML细胞增殖抑制的原因之一。4.THP-1细胞中有NF-κB信号通路的持续激活,NF-κB抑制剂PN可通过增加IκB表达,阻逆P65的核转运,有效地抑制NF-κB信号传递,从而对细胞的增殖起抑制作用。5.FLT3下调可通过诱导P65核蛋白表达下降,下调NF-κB通路活性,从而抑制细胞增殖。SMRT也是介导FLT3信号传递的重要因子,FLT3-shRNAi可通过增加SMRT的核内表达,增强其转录抑制作用。6.FLT3-shRNAi可增强THP-1细胞对PN的药物敏感性,FLT3-shRNAi与PN联合作用可通过更强地抑制NF-κB信号通路,体外实验证实有更好的抗白血病效应。7.裸鼠腹腔注射FLT3-shRNA1可通过下调FLT3表达,PN可通过抑制NF-κB活性,对THP-1细胞移植瘤组织有轻、中度的抑制作用,当二者联用时效果更为显著;FLT3-shRNA1与DNR联用时可增加DNR的抑瘤效果,体内实验证实FLT3靶向RNA干扰具有抗白血病作用。