生物体内存在着大量的小分子物质并且对生命活动十分重要作用,比如葡萄糖、氨基酸、硫化氢(H2S)、氧气和活性氧簇(ROS)等,其中葡萄糖、半胱氨酸和H2S属于还原性物质,而呼吸作用的副产物ROS,属于氧化性物质,它们的含量可以表示一个细胞或生物体处于的活动状态。为了测定这些物质,荧光探针逐渐成为生物学研究的重要手段,不仅可以通过荧光强度的测量来进行某种物质的定量,更能直接观测并追踪生物体内与该物质相关的反应过程。因此,本文设计并合成两种分子荧光探针,分别针对ROS和H2S两类物质,通过专属性的化学反应实现荧光“打开”,并以此为基础来进行生物学领域的应用。本论文主要研究内容如下：(1)构筑了一种新型的单分子荧光探针。该探针以荧光素分子为母体,通过化学反应形成一个新的五元杂环来关闭荧光素的荧光,并引入三7--醇的侧链以增强探针分子的水溶性和生物相容性。重要的是,该探针分子具备两个反应位点,可以伺时与羟基自由基(hydroxyl radicals, ·OH)和次氯酸(hypochlorous acid, HCIO)进行不同的反应,生成两种结构不同的产物,分别具有青色和绿色的荧光。(2)荧光探针能够对生物体内的ROS进行成像和可视化,并广泛地应用到生物学成像等领域,但是同时使用多种荧光探针对体内同时存在的多种ROS进行区分和成像仍然受到很大的限制,比如光谱非覆盖性荧光基团的选择、对生物体的产生的入侵效应以及各种探针不同的生物学定位等。同时,检测生物体内自发性产生的ROS还受到探针穿透各种生物障碍的能力和在生物体内的稳定性等方面因素的限制。本章中,我们使用荧光素类探针对细胞线粒体中的-OH和HCIO进行实时的区分和定量化分析,并且实现了对生物体内自发性产生的·OH和HCIO进行了成像。在斑马鱼体内,探针分子能够从肠道吸收进入血液,然后聚集在肝脏最终从肾脏排出体外,因此,探针分子能够对整个传输路径上的各个器官中的-OH和HCIO进行一种生物学意义上的描述。更有意义的是,我们还使用探针对斑马鱼新鲜伤口产生的.OH进行了首次可视化观测和成像,尽管-OH的寿命极其短,仅有数个纳秒。(3)目前,H2S是对健康评价的一个重要参数,因此使用发光探针检测H2S气体受到了广泛的关注,但是这些探针都面临着许多问题,比如较低的灵敏性、较差的选择性和水溶性以及受到背景荧光的干扰等。本文设计并合成一个超灵敏的时间分辨荧光“打开”探针,并制备试纸来检测呼出气体中的H2S。该探针是一个稀土配合物探针,以稀土金属离子Tb3+为发光中心和-N3对位取代的2,6-吡啶二羧酸作为有机配体来进行合成。在探针分子中含有3个配体,因此同时存在的3个-N3将对反应动力学十分有利,并且具有很好的溶解性。引入的一N3基团是一种强吸电子基团,能够通过分子内电荷转移(ICT)柬改变配体的能级,使配体不能有效地将能量传递给Tb3_,从而导致了发光的淬灭。当加入H：S以后,-N3还原成氨基,破坏了ICT的过程并恢复能量传递,使Tb3+,发光打开,并且具有低至纳摩尔的检测限。另外,探针分子还具有很长的荧光寿命1.9 ms,通过时间分辨荧光的手段(设置荧光收集延时为0.1 ms),能够彻底的清除具有短寿命背景荧光的干扰。更具有实用价值的是,将探针分子打印到滤纸上制备出试纸,用来检测小鼠呼出的H2S气体。