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研究目的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）在临床上高致死率、致残率。过去的50年里随机临床试验优化了肺保护性机械通气、液体治疗等ARDS管理策略,缩短了机械通气和器官衰竭时间。由于缺乏有效的治疗药物,ARDS患者的死亡率并未显著降低,同时存活患者肺纤维导致生活质量下降的后遗症日益突显。特别在新冠肺炎全球大流行中,新冠患者进展为ARDS后即使渡过了早期急性炎症因子风暴,诊断ARDS 24h内即开始发生的肺纤维化严重影响患者预后及长期生活质量,加重社会负担。多中心研究发现急性期使用糖皮质激素抑炎治疗的益处主要体现在治疗高炎症反应的ARDS患者,而长期（14天后）使用糖皮质激素可能有增加死亡率的风险,这表明ARDS发病机制还存在非炎症反应的其它重要细胞损伤机制。动物实验已验证氧化应激反应是肺损伤后发生肺纤维化的主要机制之一,而核因子红细胞-E2相关因子-2（Nrf2）信号通路是细胞中最重要的抗氧化应激通路。ARDS患者肺组织在持续应激状态下超过了机体的代偿能力,抗氧化应激系统对抗不足导致活性氧不断产生,肺上皮细胞反复遭受氧化应激损伤。持续损伤下的过度及不恰当修复大量活化肺部成纤维效应细胞,伴随分泌大量胶原并在细胞外基质沉积,最终导致肺纤维化不可逆的发生。因此,通过有效干预上调Nrf2抗氧化信号通路,以达到减轻氧化应激反应损伤是治疗ALI后肺纤维化的重要方向。褪黑素是松果体分泌的天然抗氧化剂,先前的大量研究已证明能显著激活Nrf2抗氧化应激信号通路转导,并上调下游抗氧化酶和解毒酶活性,减轻氧化应激损伤。已有学者研究发现褪黑素对肺纤维化发生及进展有显著抑制作用,但具体分子机制不完全清楚。而线粒体作为体内活性氧产生的主要场所,其自噬水平与机体活性氧水平密切相关,褪黑素能否通过调控线粒体自噬,减轻氧化应激反应改善急性肺损伤后肺纤维化目前缺少相关研究。本课题主要研究了ARDS患者早期肺部在氧化应激刺激下即开始发生纤维增生反应,而应用褪黑素可以干预Nrf2相关信号通路,并通过增强线粒体自噬减轻急性肺损伤中氧化应激损伤,抑制急性肺损伤后肺纤维化发生及进展。研究方法本课题临床研究部分通过纳入符合柏林定义标准的中重度ARDS患者作为实验组,同一周期因非ARDS因素呼吸衰竭需要机械通气患者作为对照组。收集患者临床资料,由直系亲属同意并签署知情同意书后于确诊后第1天和第7天进行支气管肺泡灌洗、胸部CT扫描。收集BALF分别检测纤维化相关标志物（NT-PCP-III、TGF-β1）、氧化应激指标（MDA、SOD）、炎症因子（TNF-α、IL-1β）水平,并对相应时间点的胸部CT进行纤维化评分。分析两组患者同一时间点临床指标、纤维增生指标浓度、炎症因子水平、氧化应激水平的差异,并进一步对ARDS组进行死亡组和存活组亚组分析,初步阐明氧化应激反应参与ARDS患者肺部早期纤维增生反应,并影响患者结局。本课题体外研究通过培养人支气管上皮16HBE细胞系,活细胞工作站观察LPS刺激下16HBE细胞发生上皮-间质转化的形态学变化,透射电镜观察EMT细胞模型线粒体变化及褪黑素的治疗作用,并运用免疫蛋白印迹和免疫荧光观察Nrf2/SQSTM1/P62信道通路在其中的作用以及褪黑素对Nrf2/SQSTM1/P62信道通路的调控作用。最后分别运用慢病毒转染16HBE敲低Nrf2基因、P62抑制剂XRK3F2处理抑制P62表达,进一步探讨褪黑素在急性肺损伤后肺纤维化进程中对Nrf2/SQSTM1/P62信道通路的调控作用及对线粒体自噬和肺上皮细胞EMT作用机制。研究结果临床研究:（1）研究期间最终纳入ARDS患者64例,非ARDS需要机械通气的对照组患者57例,相比于非ARDS组患者,ARDS组患者氧合指数更低、死亡率更高;（2）ARDS组患者入院24h内炎症反应、氧化应激水平及纤维增生指标较同期入院非ARDS患者均明显升高,且ARDS组患者第7天BALF中仍存在较高的氧化应激水平;（3）ARDS患者BALF中NT-PCP-III浓度与氧化应激水平有相关性;（4）ARDS组中相比存活患者,死亡患者入院24h BALF中氧化应激水平显著升高。体外研究:（1）LPS诱导16HBE细胞发生EMT形态学改变,并伴随总活性氧和线粒体活性氧水平增高;（2）褪黑素能够上调16HBE细胞Nrf2、P62表达水平,并通过增强线粒体自噬,减轻氧化应激反应,抑制LPS诱导的16HBE细胞EMT进程:（3）褪黑素的保护作用可通过慢病毒靶向敲低Nrf2或（和）P62抑制剂XRK3F2抑制剂处理而消失。研究结论氧化应激参与ALI/ARDS患者肺部早期纤维增生反应,并影响患者预后;褪黑素通过调控Nrf2/SQSTM1/P62信号通路增强线粒体自噬,减轻急性肺损伤肺部氧化应激反应,抑制LPS诱导的肺上皮EMT进程,最终改善急性肺损伤后肺纤维化的发生。