研究目的： 探讨灯盏花素对人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)胞浆游离Ca2+水平的调控作用，并进一步观察其对HUVECs存活率和一氧化氮(NO)合成的影响。 研究方法： 采用胰蛋白酶液灌注消化法分离获取HUVECs并进行体外培养；采用新一代Ca2+荧光探针Fluo-3标记HUVECs胞浆内游离Ca2+并结合激光共聚焦显微镜技术动态观察灯盏花素对[Ca2+]i的调控作用；MTT法检测灯盏花素对HUVECs活性的影响；用一氧化氮(NO)特异性荧光探针DAF-2DA结合激光共聚焦显微镜技术动态观察灯盏花素对人脐静脉内皮细胞NO合成的影响。 研究结果： 1.原代培养的人脐静脉内皮细胞倒置显微镜下观察，细胞呈多角形或卵圆形，边界清楚，呈单层“铺路石”状镶嵌排列。内皮细胞特异的Ⅷ因子间接免疫荧光检测，可见细胞胞浆内有绿色发亮荧光阳性反应物，纯度达到99％以上，可用于后续实验。 2.在内皮细胞胞外有无Ca2+存在的情况下，不同浓度的灯盏花素(10-11～10-5mol·L-1)均可短暂性提高HUVECs胞浆游离Ca2+水平，且[Ca2+]i的变化未见明显的浓度依赖性。 3.无Ca2+液中，先加入CPA(20μM)耗竭Ca2+后再加入灯盏花素(30μM)，并无钙释放现象发生；反之，先加入灯盏花素(30μM)或不同浓度的灯盏花素(10-11～10-5mol·L-1)耗竭Ca2+再加入CPA(20μM)，仍可继续引起钙释放。 4.Bayk-8644是L-型电压依赖性Ca2+通道的激活剂，有Ca2+液中，Bayk-8644能够引起内皮细胞[Ca2+]i升高，表明内皮细胞存在电压依赖性Ca2+通道。 5.有Ca2+液下，加入KCl(60mM)可引起HUVECs胞浆游离Ca2+水平快速升高及持续性Ca2+内流形成一个平台，然后依次加入不同浓度的灯盏花素(10-11～10-5mol·L-1)，可见[Ca2+]i降低，提示灯盏花素能够阻断电压依赖性的钙内流。 6.灯盏花素(10μM)预孵HUVECs30min后可以抑制由KCl(60mM)触发的[Ca2+]i升高，未经处理组中KCl(60mM)引起的[Ca2+]i变化程度为129.37±48.77％，预孵组中KCl(60mM)引起的[Ca2+]i变化程度为97.35±38.18％，两组之间有显著性差异(n=5,P＜0.01)；但灯盏花素预孵对Phe(10μM)引起的[Ca2+]i升高无抑制作用，未经处理组Phe(10μM)引起的[Ca2+]i变化程度为54.03±16.03％，预孵组Phe(10μM)引起的[Ca2+]i变化程度为56.88±18.47％，两组之间无显著性差异(n=5，P＞0.05)。 7.无Ca2+液中，Phe(10μM)引起的[Ca2+]i变化程度为210.07±65.16％，灯盏花素(30μM)引起的[Ca2+]i变化程度为208.40±64.87％，两组之间无显著性差异(n=5，P＞0.05)；复钙后，[Ca2+]i变化程度为Phe组255.16±73.67％，灯盏花素组273.14±69.61％，两组之间无显著性差异(n=5，P＞0.05)，提示灯盏花素对Ca2+池耗竭后胞外复Ca2+引起的Ca2+内流无明显阻断作用。 8.不同浓度的灯盏花素(10-11～10-5mol·L-1)处理HUVECs48h，细胞的存活率分别为106.51±8.41％、103.72±6.31％、101.32±5.83％、100.93±7.01％(n=6，P＞0.05,vs.control)；处理72h，细胞的存活率分别为105.19±6.81％、107.36±4.85％、107.93±9.10％、104.40±3.19％(n=6，P＞0.05,vs.control)，提示灯盏花素对内皮细胞增殖的影响不明显。 9.不同浓度的灯盏花素(10-11～10-5mol·L-1)均可短暂性提高HUVECs胞浆NO水平，且[NO]i的变化未见明显的浓度依赖性。 10.无Ca2+液下，加入L-Ag(0.5mM)，可见[NO]i短暂性升高，稳定后再加入CPA(20μM)，仍可观察到[NO]i升高现象，接着加入灯盏花素(30μM)，[NO]i未见变化；反之先加入灯盏花素(30μM)，可观察到[NO]i短暂性升高现象，接着加入CPA(20μM)，[NO]i略微升高。 11.有Ca2+液下，加入L-Ag(0.5mM)，可见[NO]i短暂性升高，稳定后再加入灯盏花素(30μM)，仍可观察到[NO]i短暂性升高现象，接着加入KCl(60mM)，[NO]i变化不大。 研究结论： 1.采用胰蛋白酶液灌注消化法获得人脐静脉血管内皮细胞并进行体外培养，此方法获取内皮细胞的成功率高、纯度高，为本系列研究提供了细胞保证。 2.在内皮细胞细胞外有或无Ca2+存在的情况下，灯盏花素均可触发钙释放，且无明显的量效关系。灯盏花素提高HUVECs[Ca2+]i可能是通过阻断内质网的钙泵途径实现。 3.电压依赖性钙离子通道存在于内皮细胞上。 4.灯盏花素能够阻断电压依赖性钙离子通道的钙内流，但对内皮细胞胞内Ca2+池耗竭后胞外复Ca2+所引起的Ca2+内流无明显的阻断作用。 5.灯盏花素对内皮细胞增殖的影响作用不明显。 6.灯盏花素能够促进内皮细胞NO的合成，其机制可能与灯盏花素的钙释放作用相关联。