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肠致病性大肠杆菌( E. coil)引起的仔猪腹泻是危害养猪业的重要疾病之一。主要表现为严重的腹泻、脱水,并导致大批仔猪死亡,严重影响仔猪的成活率。由于E. coli耐药菌株的不断出现,导致药物治疗的效果越来越差,因此研制有效预防仔猪大肠杆菌性腹泻的疫苗对预防该病的发生具有重要的实际意义。肠致病性E. coli的流行情况复杂,其携带的毒力因子在不同的国家或地区的流行情况不同,即使在同一地区,毒力因子在不同年份的流行情况也有差别。本研究旨在对近年肠致病性E. coli毒力基因分布进行调查,为疫苗抗原基因的选择提供依据：根据仔猪大肠杆菌性腹泻的感染特点,探索以减毒大肠杆菌作为口服疫苗投递载体的可行性。本研究从38个规模化猪场采集了290份粪便样品,从中分离得到了381株E. coli,对E. coli分离株进行了毒力因子菌毛(K88、K99、987P、F41、F18、F17)、非菌毛黏附因子(AIDA-I, paa, CS31A, eae, saa),肠毒素(LT-Ⅰ、LT-Ⅱ、STa、STb、EAST1 ),志贺毒素(Stx1、Stx2、Stx2e)、毒力岛(HPI、LEE)、a-溶血素(hlyA),afa8基因簇(afaD, afaE)及sepA基因的PCR检测。结果显示,在381株E.coli中,有206株携带至少一个毒力基因。这些毒力基因的检出结果分别为EAST1 (n= 120), irp2 (n= 59), paa (n= 50), STb (n= 41), AIDA-I (n= 34),LT-I(n=23)、ler(n=11)、hlyA(n=9)、K88(n=8)、eae(n=8)、STa(n=7)、sepA (n = 6),F18(n=5)、afaD(n=3)、afaE(n=3),K99(n=2)及Stx2e (n= 1),而且,大多数菌株同时携带多个毒力因子。在检测的毒力基因中,EAST1 (58%),irp2(29%)、AIDA-I(16.5%)、paa(24%)及STb(20%)的检出率较高,黏附因子的检出率较低,在206株携带毒力基因的E. coli中,超过半数的菌株不携带任何黏附因子。仔猪大肠杆菌性腹泻主要是以消化道为感染途经,因此,口服疫苗免疫更接近自然感染过程。本研究用G-DOC及~. Red同源重组系统敲除了野生E. coli O142中的STa基因,构建了减毒E. coli O142: /kSTa,选择其假基因yaiT为抗原基因插入位点,建立分别以Kil基因和mKate2基因为筛选标记的双向筛选平台。在此基础上,用同源重组技术分别构建表达嵌合类毒素LT192-STaI3及LTI92-STb的重组大肠杆菌ER-A和ER-B,并对其肠毒性、消化环境生存能力、口服安全性、生长能力、遗传稳定性、菌毛生长能力、肠道定植能力进行了检测,评估了这两株重组E. coli作为口服疫苗的免疫效果。重组菌主要生物学特性研究结果显示,重组菌ER-A及ER-B不具有肠毒性；在pH2.5和pH3.5的胃液中均能保持较高的存活率,在模拟肠液中可生长,在0.05%的胆汁酸盐环境中生长良好；分别以109CFU和1010CFU的ER-A和ER-B口服免疫小鼠,小鼠的日采食量和精神况与对照组小鼠无明显差异,安全性良好；ER-A及ER-B与初始菌E. coli O 142及毒素基因敲除的E. coil O142: /kSTa的生长曲线几乎一致,说明STa毒素基因的敲除和类毒素基因的插入对菌体的生长代谢没有造成影响；ER-A及ER-B在连续100次传代后,插入的LTI92-STaI3和LTI92=STb操纵子未见丢失,具有良好的遗传稳定性；ER-A及ER-B的菌体表明可正常的长出菌毛,说明STa毒素基因的敲除和类毒素基因的插入未影响菌毛的生长；ER-A及ER-B可在小鼠肠道内长时间存活,说明其具有良好的肠道定植能力。重组菌ER-A及ER-B对BALB/c小鼠口服免疫效果检测结果显示,ER-A免疫组(A组)、ER-B免疫组(B组)、混合免疫组(M组)小鼠在首次免疫后的7-21d,在其血清中均可检测到抗LTA(P<0.05)、LTB(P<0.05)、STa(P<0.05)、STb(P<0.05)、F41(P<0.05)的IgG抗体,首次免疫后第42d,小鼠乳汁、脾脏、肠系膜淋巴结及肠黏液中几乎都能检测到抗LTA(P<0.05)、LTB(P<0.05)、STa(P<0.05)、STb(P<0.05)、F41(P<0.05)的IgG抗体；各免疫组的小鼠在首次免疫后的7-28d,在其粪便中均可检测到抗LTA(P<0.05)、LTB(P<0.05)、STa(P<0.05)、STb(P<0.05)、F41(P<0.05)的IgA抗体,首次免疫后第42d,小鼠乳汁、脾脏、肠系膜淋巴结及肠黏液中几乎都能检测到抗LTA(P<0.05)、LTB(P<0.05)、STa(P<0.05)、STb(P<0.05)、F41(P<0.05)的IgA抗体。与对照组脾细胞和肠系膜淋巴细胞增殖效果相比,A、B和M免疫组都具有更强的刺激增殖效果(P<0.05),脾细胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值与对照组相比差异不明显,而肠系膜淋巴细胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值小于1,发生了显著的平衡漂移,与对照组相比差异明显,说明本研究对小鼠的口服免疫没有能够刺激小鼠全身的Th型细胞免疫应答,但刺激小鼠产生了局部黏膜的Th2类细胞免疫反应。A、B和M组小鼠的血清、肠粘液、脾细胞裂解液、肠系膜淋巴细胞裂解液可对肠毒素产生明显的中和效果。重组菌ER-A及ER-B对猪口服免疫效果检测结果显示,ER-A及ER-B可在猪肠道内长时间存活,有良好的肠道定植能力。ER-A免疫组(A组)、ER-B免疫组(B组)、混合免疫组(M组)猪在首次免疫后的7-28d,在其血清中均可检测到抗LTA(P<0.05)、LTB(P<0.05)、STa(P<0.05)、STb(P<0.05)、F41(P<0.05)的IgG抗体,首次免疫后第42d,猪的乳汁、脾脏、肠系膜淋巴结及肠黏液中几乎都能检测到抗LTA(P<0.05)、LTB(P<0.05)、STa(P<0.05)、STb(P<0.05)、F41(P<0.05)的IgG抗体；A、B和M组猪在首次免疫后的14-28d,在其粪便中均可检测到抗LTA(P<0.05)、LTB(P<0.05)、STa(P<0.05)、STb(P<0.05)、F41(P<0.05)的IgA抗体,首次免疫后第42d,小鼠乳汁、脾脏、肠系膜淋巴结及肠黏液中几乎都能检测到抗LTA(P<0.05)、LTB(P<0.05)、STa(P<0.05)、STb(P<0.05)、F41(P<0.05)的IgA抗体。与对照组脾细胞、肠系膜淋巴细胞及血液淋巴细胞的增殖效果相比,A、B和M组都具有更强的刺激增殖效果(P<0.05)。活菌免疫组的脾细胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值与对照组相比差异不显著,而肠系膜淋巴细胞中Th1(IFN-γ)/Th2(IL-4)比值小于1,发生了显著的平衡漂移,与对照组相比差异显著(P<0.05),说明本研究对仔猪的口服免疫没有能够刺激仔猪全身的Th型细胞免疫应答,但刺激仔猪产生了局部黏膜的Th2类细胞免疫反应。A、B和M组仔猪的血清、肠粘液、脾细胞裂解液、肠系膜淋巴细胞裂解液可对肠毒素产生明显的中和效果。各免疫组的仔猪在攻毒后,其肠绒毛高度、隐窝深度、肠绒毛高度／隐窝深度比值与对照组相比,差异显著(P<0.05)。本研究通过对猪源肠致病性E.coli毒力基因的调查,明确了当前主要流行的菌株主要携带EAST1、irp2、AIDA-I、paa和STb等毒力基因,很少携带黏附因子基因,为疫苗抗原基因的选择提供了依据：重组菌ER-A和ER-B对小鼠和猪的免疫效果检测证明,口服疫苗可以诱导小鼠和猪良好的体液免疫和细胞免疫应答,对仔猪具有免疫保护作用,展现了减毒大肠杆菌作为抗原呈递载体的良好前景。