论文部分内容阅读
研究背景在女性恶性肿瘤中,乳腺癌的发病率居高不下,对女性健康产生严重危害。据统计,其在世界范围内发病率居于女性恶性肿瘤第一位,约占女性恶性肿瘤的25%,其死亡率约占肿瘤总死亡率的15%1;我国乳腺癌的发病率和死亡率均高居女性恶性肿瘤之首,且发病率逐年快速增加,在乳腺癌的死亡原因中,远处转移是其主要致死原因,而在远处转移中,肺转移最常见2-5。当前,以抗体治疗、细胞治疗和基因治疗为代表的生物治疗发展迅速,其通过多种方式激活机体内在免疫功能,从而增强机体对肿瘤细胞的免疫应答,使宿主对肿瘤细胞产生长期抑制效应。基因治疗作为肿瘤治疗的前沿技术,主要利用多种病毒或非病毒载体,将目的基因导入靶细胞,实现目的基因的靶向和高效表达,从而治疗疾病。Decorin（DCN）是重要的肿瘤抑制分子,已在多种肿瘤模型中证实具有肿瘤抑制效应6-13,但是其对乳腺癌及乳腺癌肺转移的治疗作用及机制尚不明确。本课题通过溶瘤腺病毒表达Decorin蛋白,检测其对乳腺癌及其肺转移的治疗效果,希望为乳腺癌提供一种新的有效的基因治疗方案。目的:通过系统或者局部给药的方法,使用携带Decorin基因的溶瘤腺病毒rAd.DCN对乳腺癌肺转移模型鼠进行治疗,从而在动物水平明确溶瘤腺病毒rAd.DCN对乳腺癌肺转移的治疗效果,并初步阐明其作用机制,为乳腺癌肺转移的治疗探索更加有效的基因治疗方案。研究方法:（1）收集临床乳腺癌患者的手术切除标本,通过实时定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction q RT-PCR）技术检测Decorin在肿瘤组织和癌旁组织表达的差异性;（2）将4T1细胞系转染Ad.DCN和Ad.Null后与小鼠脾脏细胞共培养,检测其体外作用。（3）在雌性Balb/c小鼠第三、四脂肪垫注射转染荧光素酶报告基因的小鼠4T1-luc乳腺癌细胞,建立小鼠乳腺癌肺转移的移植瘤模型。（4）采用瘤内给药和全身给药两种给药方式,使用治疗溶瘤腺病毒rAd.DCN和对照溶瘤腺病毒rAd.Null对模型小鼠进行治疗。（5）疗效评价:给药后观察小鼠的健康状况;小动物活体成像观察肿瘤组织大小;利用游标卡尺检测肿瘤体积;以对照组肿瘤破溃或肿瘤体积大于2000mm3为治疗终点,治疗终点剥离小鼠移植瘤,肿瘤组织称重;通过组织病理学方法观察肺脏转移瘤情况。（6）rAd.DCN治疗小鼠乳腺癌肺转移的机制研究:于治疗后不同时间点,采集小鼠外周血,分离血清,检测多种细胞因子表达;采集外周血,检测小鼠T淋巴细胞亚群表达情况;于治疗终点,处死小鼠,剥离小鼠移植瘤,取完整肺组织。采用实时定量PCR的方法和免疫组织化学方法检测肿瘤组织Decorin的表达水平;采用实时定量PCR检测肺脏组织局部Decorin靶基因的表达水平;采用免疫组化的方法检测肿瘤组织中腺病毒的分布情况和细胞凋亡及细胞增殖情况。结果:（1）以人乳腺癌组织及癌旁组织为研究对象,共34对样品。以β-actin为内参,采用q RT-PCR方法测定癌旁组织和癌组织中h DCN的表达。结果可见肿瘤组织中DCN的表达明显低于癌旁组织。（2）Decorin可以增强乳腺癌细胞系对小鼠脾脏细胞的免疫激活作用。其通过抑制Treg细胞的比例,改善肿瘤微环境的抑制;通过增加Tmemory细胞的比例,增强机体的抗肿瘤免疫;通过调节Th细胞因子的表达,达到调节免疫的作用;还可以通过增加穿孔素和颗粒酶的表达,增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。（3）利用转染荧光素酶报告基因的小鼠4T1-luc乳腺癌细胞,以6.5×105细胞/只小鼠进行脂肪垫注射雌性Balb/c小鼠,于不同时间进行活体成像及病理检测,成功建立乳腺癌肺转移动物模型。（4）利用治疗溶瘤腺病毒rAd.DCN和对照溶瘤腺病毒rAd.Null,以2.5×1010VPs/只小鼠的剂量分别对模型动物进行瘤内给药和全身给药治疗,治疗后3d重复给药一次。于实验的不同时间点取得相应标本进行检测,并对数据进行分析,结果显示:（1）rAd.DCN可以抑制乳腺癌原位移植瘤生长及肺转移;（2）rAd.DCN可介导DCN基因在肿瘤组织内表达,进而下调其靶基因和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition EMT）相关分子的表达;（3）rAd.DCN可以抑制肿瘤细胞的增殖并且促进细胞凋亡;（4）rAd.DCN可聚集于肺部表达Decorin,该产物可以调节其靶基因的表达和炎症反应;（5）rAd.DCN通过调节系统炎性反应抑制肿瘤生长和转移;（6）rAd.DCN和rAd.Null提高外周血CD8+T淋巴细胞比例,从而加强抗肿瘤免疫应答。结论rAd.DCN通过3种途径发挥抑制乳腺癌生长及其肺转移的作用:（1）wnt/β-catenin通路;（2）血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor VEGF）和间质表皮转化因子（mesenchymal to epithelial transition factor MET）信号通路;（3）调节炎症反应和免疫反应应答。与瘤内注射相比,静脉注射能更有效的抑制肺转移的发生,这一结果将为乳腺癌肺转移提供一种有前景的治疗策略。