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本研究构建了斜带石斑鱼生长激素的毕赤酵母高效表达系统。毕赤酵母是种常用的外源基因表达系统,现已有多种医药蛋白在该系统中获得表达。在本研究中,利用甲醇诱导型启动子AOX1和组成型启动子GAP驱动斜带石斑鱼生长激素基因在毕赤酵母表达系统中以分泌方式获得了高效表达。为了提高甲醇诱导型表达酵母菌株和组成型表达酵母菌株的表达水平,我们利用“核心模板法”PCR人工合成了斜带石斑鱼生长激素成熟肽(gGH)基因的核苷酸序列,方法是根据gGH的氨基酸序列和毕赤酵母遗传密码子的偏爱性设计新的核苷酸序列,并设计出10条引物,通过三轮PCR反应获得人工合成的基因。另外,我们通过两次转化人工合成基因表达盒,并利用Zeocin抗生素浓度梯度筛选法筛选到了含有多拷贝外源基因表达盒的毕赤酵母转化菌株。研究结果显示利用人工合成的基因表达gGH能获得了更高的表达水平;在甲醇诱导型转化子中,外源基因的拷贝数与gGH的表达量有直接的关系。甲醇诱导型菌株在培养96h时,gGH的表达水平达到最高,表达量为400-500mg/L,此时菌的生长密度为24.5(OD600);组成型启动子GAP驱动的gGH的表达未导致细胞死亡,而且只需培养24h,不需补充碳源,gGH表达量即可达到80mg/L。甲醇浓度对gGH的表达和菌增值的影响非常明显,研究表明以0.5%甲醇浓度作碳源,菌的增值未受到甲醇毒副作用的影响,且诱导产生的gGH表达量最高。
上述的研究都是用摇瓶小规模的表达gGH,由于毕赤酵母非常适合于高密度发酵培养,因此当大规模高密度发酵培养时,gGH的表达量将会提高10倍。显然有必要进一步优化表达条件以充分发挥毕赤酵母的潜能。本研究工作将会进一步促进鱼类生长激素的功能研究,及重组鱼类生长激素在海水鱼类养殖的开发利用。