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【研究背景与目的】造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）是造血系统的基石,它可以分化增殖为定型的祖细胞和前体细胞,最终产生机体所需的各种成熟的血细胞。在生物体的整个生命周期中,只有HSC可以完全重建生物体的造血系统,以维持造血稳态。虽然小鼠HSC的比例仅为0.01%,大约每10000个骨髓细胞里只含有一个HSC。一个造血干细胞即可重建机体的整个造血系统。因此,在机体内维持HSC的增殖、自我更新、多向分化,需要复杂而准确的调控。HSC的失调会导致多种疾病的发生,包括免疫功能缺陷,贫血,白血病,造血功能衰竭和死亡。因为在体内研究人造血系统的发育有很大的困难性,所以本实验采用模型小鼠进行造血系统的研究。多种因素可以影响HSC的自我更新和分化,包括细胞外信号蛋白,染色质重塑,DNA甲基化,剪接因子,转录因子,lnc RNA,micro RNAs,翻译和翻译后蛋白修饰。微小RNA（miRNAs）是小RNA分子,其作用类似于小干扰RNA（Small interfering RNA,si RNA）,广泛存在于真核生物中（长约19-25bp）。大量研究表明miRNA在多种疾病的发生发展中起着重要的调控作用,其可以作为疾病预后和诊断的一个标志物。多种miRNA调控HSC的自我更新及其终末分化,在造血调控中起着非常重要的作用。同时,相对于造血祖细胞,miR-100在HSC中是高表达的。但是它的机制不清?在机体造血期间,骨髓中的髓系祖细胞（CMP）产生大量的髓系细胞,包括单核细胞,粒细胞,红细胞和血小板,这些细胞构成我们机体天然免疫系统的重要组成部分。除了淋巴细胞之外,髓系细胞也是多种肿瘤细胞浸润免疫细胞的重要成分。含有活动精子结构域的蛋白2（MOSPD2）是一种内质网（ER）驻留蛋白,它可以作用于内体、线粒体和高尔基体中的酸性区域中两个苯丙氨酸（FFAT）的系链蛋白。研究发现,利用基因沉默和单克隆抗体技术,Mospd2在体外促进了髓系细胞的迁移。通过Target Scan数据库预测Mospd2是miR-100的生物靶点。ARGONAUTE-2蛋白是一种在人体中由EIF2C2基因编码的蛋白质。ARGONAUTE-2和相关的miRNA形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）,其靶向m RNA进行翻译沉默和降解,作为RNA干扰途径的一部分。基于此,使用CRISPR-Cas9基因编辑技术和重组酶系统—Cre/lox P构建了miR-100基因全身敲除的小鼠,并通过q PCR验证miR-100在小鼠脾脏和骨髓中的敲除效率。研究miR-100在小鼠造血调控中所起的作用以及它和Mospd2的关系。【研究方法】（1）将EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠与EIIa-Cre-;miR-100fl/fl小鼠配繁;得到EIIa-Cre+;miR-100fl/+小鼠（此为miR-100半敲除的小鼠）。然后我们将EIIa-Cre+;miR-100fl/+基因型小鼠与EIIa-Cre+;miR-100fl/+基因型小鼠配繁,最后我们得到EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠（此为miR-100全身敲除小鼠）。（2）从小鼠鼠尾提取DNA,利用普通PCR进行扩增,并通过跑琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型鉴定。（3）通过q PCR验证6-8W的EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠脾脏和骨髓中miR-100表达。（4）通过血细胞计数分析6-8W的EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠外周血中白细胞和红细胞的数量。（5）通过流式细胞术分析6-8W的EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠外周血中髓系细胞和T/B淋巴细胞的比例。（6）通过血细胞计数仪分析6-8W的EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠总的骨髓和脾脏血细胞计数。（7）通过流式细胞术分析6-8W的EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠骨髓和脾脏的髓系细胞、T/B淋巴细胞和红细胞的比例和绝对细胞计数。（8）通过流式细胞术分析6-8W的EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠骨髓中的造血干细胞及造血祖细胞的比例和绝对细胞计数。（9）通过甲基纤维素集落形成实验研究小鼠骨髓细胞中miR-100敲除对小鼠干祖细胞功能的影响。（10）通过q PCR验证6-8W的EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠骨髓中Mospd2的表达。（11）通过RIP实验验证miR-100与Mospd2之间的关系。【实验研究结果】1.成功构建了EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠与EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠。2.提取小鼠的基因组DNA,通过小鼠基因型鉴定检测出EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠。3.通过q PCR验证,与EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠相比,EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠骨髓和脾脏的miR-100表达明显降低。4.通过血细胞计数分析,与EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠相比,EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠外周血白细胞明显增多,但两者的红细胞没有明显差异。5.通过流式细胞术分析,与EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠相比,EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠外周血中髓系细胞比例增多,但两者的T/B淋巴细胞比例没有明显差异。6.通过血细胞计数分析,EIIa-Cre+;miR-100+/+和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠骨髓和脾脏总的血细胞计数没有明显差异。7.通过流式细胞术分析,EIIa-Cre+;miR-100+/+和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠的骨髓和脾脏、髓系细胞、T/B淋巴细胞和红细胞的比例和绝对细胞计数没有明显差异。8.通过流式细胞术分析,EIIa-Cre+;miR-100+/+和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠骨髓造血干祖细胞比例和绝对细胞计数没有明显差异。9.通过甲基纤维素血细胞集落形成实验,EIIa-Cre+;miR-100+/+和EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠骨髓单个核细胞集落形成能力无差异。10.通过q PCR验证,与EIIa-Cre+;miR-100+/+小鼠相比,EIIa-Cre+;miR-100fl/fl小鼠骨髓中Mospd2表达明显增高。11.通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验验证,miR-100以Ago2蛋白复合物的形式与Mospd2结合在一起。【结论】1.MiR-100缺失可以促进小鼠外周血髓系细胞比例增多。2.MiR-100缺失可以促进小鼠骨髓细胞中Mospd2的表达。3.MiR-100以Ago2蛋白复合物的形式与Mospd2结合在一起。