糖尿病性膀胱病(diabetic cystopathy,DCP)是糖尿病患者常见的慢性并发症之一,在2004年,Lee等统计DCP的患病率为25%?90%。在2011年,统计约有22.5%的糖尿病患者表现为膀胱过度活动症,而在这些病例中又有48.0%的患者伴有尿失禁临床症状。DCP的发病机制主要包括神经病变、逼尿肌肌源性病变和氧化应激损伤等,氧化应激损伤是糖尿病膀胱功能损伤的重要因素,有效降低机体内氧自由基的水平对保护糖尿病动物模型的神经及血管结构功能十分有利。至今为止,针对DCP的药物仍需要继续探索,利用天然抗氧化剂治疗DCP已逐渐被推崇为研究的新热点。肌苷是临床上多年广为应用、无明显不良反应的药物,而且大量研究表明肌苷能有效对抗氧化应激损伤机体,提高细胞对缺氧、缺血的耐受力。Piezos离子通道是机械敏感性离子通道中的一种,其可感受细胞膜所受机械刺激的改变,立即作出反应,将细胞膜感受到的机械信号转化为电信号或化学信号。在2010年,由Corey和Hudspeth等人研究发现,在哺乳动物中,该通道家族包含Piezo1和Piezo2蛋白,分别由FAM38A和FAM38B基因编码。Piezos离子通道存在于许多组织中,如膀胱、肾脏及神经等,并且研究发现,Piezos基因及其表达的蛋白与机体一些病理生理过程相关,如Dehydrated hereditary stomatocytosis(DHS)、Distal arthrogyposis type 5(DA5)、Gordon syndrome(GS)、Marden-Walker syndrome(MWS)等。目前,Piezos通道蛋白在DCP中表达情况,少有文献报道,本实验以链尿佐菌素(Streptozocin STZ)诱导糖尿病大鼠模型,观察糖尿病对大鼠膀胱组织Piezos离子通道的影响情况,并用肌苷进行干预治疗,分析肌苷对糖尿病大鼠膀胱组织中Piezos离子通道的保护作用,为DCP的药物治疗探索一个新的研究方向。第一部分肌苷治疗DCP的形态学分析及相关氧化指标测定目的:目前针对DCP的治疗仍缺乏有效药物,研究天然抗氧化剂已经逐渐成为当今的新热点。本研究目的在于观察肌苷对糖尿病大鼠膀胱的保护作用以及探索肌苷的抗氧化应激机制。方法:将60只成年大鼠随机分为正常对照组,糖尿病组和糖尿病肌苷治疗组,每组大鼠各20只,给予链脲佐菌素(60mg/kg)一次性腹腔注射以诱导糖尿病大鼠模型,1周后取尾静脉血,测血糖水平≥16.7mmol/L达到造模成功的标准。造模成功后肌苷治疗组接受肌苷(75 mg/kg,ip,bid)治疗,糖尿病组接受同量生理盐水。肌苷治疗干预4周、8周后,在两个时间点分别从各组中取10只大鼠,取膀胱组织切片做苏木精-伊红(HE)染色、用免疫荧光法观察膀胱组织中干细胞因子受体(c-kit)、神经生长因子(Nerve growth factor NGF)表达情况,电镜下观察各组大鼠膀胱组织的超显微结构。同时对大鼠膀胱组织进行TUNEL凋亡分析,并测定膀胱组织中谷胱甘肽(Glutathione GSH)、丙二醛(Malondialdehyde MDA)以及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase SOD)的含量和活性。结果:糖尿病组大鼠膀胱组织HE染色提示黏膜显著增生,肌束排列紊乱,结构松散,肌束断裂,肌束间间隙明显增宽,肌细胞萎缩,淋巴细胞浸润,肌束间胶原纤维填充,血管增生充血,神经束少见;在电镜下观察,可见肌细胞排列紊乱,中间连接消失,肌细胞和间质细胞内线粒体空泡化显著,核膜皱缩,核仁消失,染色质不规则边集,凝聚成块;免疫荧光结果提示NGF和c-kit信号均较正常对照组减弱;TUNEL检测显示凋亡细胞比例显著增多,MDA在8周时显著增加,SOD,GSH则显著减少。肌苷治疗组大鼠膀胱组织及细胞结构较糖尿病组显著改善,NGF和c-kit信号显著增强,凋亡细胞比例显著减少,且以上改善肌苷治疗组在4周和8周时无显著差别,8周时肌苷治疗组膀胱组织中MDA含量较糖尿病组显著减少。结论:氧化应激在DCP的发生和发展中起重要作用,肌苷能有效降低糖尿病大鼠膀胱组织中氧化应激水平,减轻糖尿病大鼠膀胱组织的受损程度,保护膀胱的组织结构和功能。第二部分肌苷对糖尿病大鼠膀胱组织piezos离子通道表达及分布的影响目的:观察糖尿病大鼠膀胱组织内piezos离子通道变化及肌苷(inosine)对糖尿病大鼠膀胱组织内piezos离子通道的影响情况。方法:将54只大鼠随机分为正常对照组(NC组),糖尿病对照组(DM组)和糖尿病肌苷治疗组(Inosine组),每组18只大鼠,DM组和Inosine组大鼠分别给予链脲佐菌素(60mg/kg)一次性腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型,1周后测血糖在16.7mmol/L以上,视为造模成功。造模成功后,Inosine组大鼠腹腔注射肌苷(75 mg/kg,ip,bid)治疗,DM组接受同量生理盐水。在肌苷治疗1、2、8周后,各组分别取3只大鼠,用免疫荧光法观察大鼠膀胱组织中c-kit、Piezo1表达情况。再取3只大鼠,用QPCR定量分析Piezo1和Piezo2基因表达水平,并通过Western blot对大鼠膀胱组织内Piezo1和Piezo2蛋白表达水平分析比较。结果:在肌苷治疗1、2周后,Inosine组Piezo1和Piezo2基因及蛋白表达水平与NC组无显著差别(P>0.05),DM组Piezo1和Piezo2基因及蛋白表达水平较NC组和Inosine组显著增高(P<0.05),在肌苷治疗第8周后,NC组、DM组和Inosine组大鼠膀胱组织中Piezo1和Piezo2基因及蛋白表达水平无显著差别(P>0.05)。结论:DCP初期,大鼠膀胱组织中Piezo1和Piezo2基因肌蛋白表达水平可显著增加,增强膀胱对机械刺激的敏感性,是产生尿频症状的重要因素之一,而肌苷可显著抑制Piezo1和Piezo2增加,从而保护膀胱功能。