研究背景与目的2015年2月4日,发表的《2012全球癌症统计》的全文,基于GLOBOCAN估计,在2012年,全球约有1.41千万新发癌症病例,820万患者死于癌症。其中57%的癌症患者以及65%的癌症死亡患者来自于发展中国家。统计结果显示不论是发达国家还是发展中国家,肺癌是男性的首位癌症死因。对于发达国家,肺癌已越过乳腺癌成为女性的首位癌症死因。我国肺癌的发病也呈现了明显的地区聚集特性,云南是癌症高发区之一,尤其是女性肺癌的发病率是世界上发病率最高的地区之一。肺癌起源于支气管粘膜上皮,肺癌发病隐匿,恶性程度高,大多数肺癌患者就诊时已是晚期。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,非小细胞肺癌最为常见,约85%的肺癌患者属于这种类型。目前研究认为,肺癌的发生与多种因素有关,主要原因有吸烟、环境污染和氡暴露等。靶向治疗、手术治疗、放射治疗、化学疗法和免疫治疗等为目前肺癌的主要治疗方法。目前的研究认为,肺癌的形成,尤其是非小细胞肺癌的形成,涉及到很多基因和信号通路,有研究认为,引起肺癌发生发展的重要分子基础是各基因间和各信号通路的紊乱。因此,探索与非小细胞肺癌发生发展相关的重要基因及其调控的信号通路将有助于我们进一步揭示肺癌的发病机理,发现早期诊断肺癌的分子标志,为其分子靶向治疗提供依据。烯醇化酶(enolase)是一类古老的蛋白,发现于1934年,是在研究肌肉提取物中磷酸甘油酸向丙酮酸转换的过程中被Lohman和Mayerhof发现的。烯醇化酶作为糖酵解过程中的一个关键酶,其一能催化糖酵解中的2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸,其二可在糖原合成过程中催化逆向反应,故烯醇化酶在细胞能量代谢过程中起着重要的作用。在脊椎动物中主要有三种烯醇化酶:cα-烯醇化酶、β-烯醇化酶和γ-烯醇化酶。α-烯醇化酶,即ENO1,广泛存在于多种组织中,β-烯醇化酶主要存在于肌肉组织,γ-烯醇化酶则主要见于神经元和神经内分泌细胞。ENO1是一种糖酵解酶,ENO1基因的表达主要编码两种不同的蛋白质,在很多生理病理过程有着重要的作用。通常情况下,ENO1主要定位于细胞质中,作为胞浆糖酵解酶,其蛋白分子量为48kDa。随后,又有研究人员发现,在细胞核内存在ENO1同源异构体—c-Myc启动子结合蛋白(c-Myc promoter-binding protein,MBP-1),它是由定位于1号染色体上的ENO1基因编码的一种分子量为37kDa的蛋白质,起着负性调控c-Myc的作用。因此,ENO1基因可形成两个转录本,其中转录本1(ENO1)可编码一种较长的48kDa的蛋白异构体,其主要定位于细胞质,具有烯醇化酶活性;转录本2(MBP-1)与转录本1(ENO1)在5’端稍有不同,从读码框下游的起始密码子起始翻译,编码一种较短的37kDa的蛋白异构体,其主要位于细胞核,负性调控c-Myc的转录,发挥抑癌基因的作用。因此,ENO1的功能有参与转录调控、细胞分化过程和催化糖酵解反应等。有研究认为,ENO1能够抑制肿瘤细胞的生长,但也有大量研究认为,ENO1的mRNA和蛋白水平在许多肿瘤中均上调,ENO1很可能是一个在肿瘤的生长和转移等过程中发挥着重要作用的癌基因。除此之外,有研究人员发现,ENO1的糖酵解活性与ATP柠檬酸裂合酶的表达上调有关系,认为ENO1也可能是一个肿瘤代谢的促进因子,能使高表达ENO1的肿瘤细胞更具有生长优势。由此我们也可以看出,ENO1虽然是一个古老的蛋白,但它的功能还有待进一步的探索。虽然早期大多数研究都认为ENO1发挥着抑癌基因的作用,能够抑制肿瘤细胞的生长,然而近年来有大量的研究发现ENO1可能在肿瘤中主要发挥着癌基因的作用。B.Altenberg等发现ENO1在包括肺癌在内的多种肿瘤中均表达上调,提示ENO1可能发挥着促癌作用。甲状腺嗜酸细胞瘤、神经胶质瘤、肝癌和黑色素细胞瘤等肿瘤研究报道ENO1发挥着癌基因功能。QishengLuo等发现ENO1在胶质瘤内高表达,ENO1在胶质瘤中的表达与病理分级呈正相关,且与患者预后呈负相关,体外体内实验均表明ENO1能够促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭转移。Baris和Suzuki分别利用基因表达谱和2D凝胶电泳鉴定发现ENO1基因在甲状腺嗜酸细胞瘤和黑色素细胞瘤中均表达上调,提示ENO1在这两种肿瘤中可能发挥癌基因的作用。Takashima等发现肝癌中ENO1是高表达,其表达水平与肝癌的恶性程度呈正相关,与肿瘤大小呈正相关。另外,此研究还发现ENO1的表达水平越高,肿瘤的血管侵袭程度越明显。此外,多篇文献报道,在多种肿瘤患者的体液(血液、积液、唾液等)中,均检出ENO1自身抗体的水平与肿瘤的分化、分期及预后呈正相关。在对ENO1促进肿瘤细胞进展机制的研究中,很多研究人员认为ENO1促进肿瘤细胞的生长过程可能是ENO1对细胞能量代谢的影响起到了主要作用。尽管ENO1在许多肿瘤中均有报道,也有关于ENO1在肺癌中表达水平的报道,但不同的研究人员发现ENO1在肺癌中有不同的表达水平,一些研究人员认为ENO1在非小细胞肺癌组织中高表达,并且其表达水平与预后呈负相关。但也有一些报道与之相反,Chang Y.S等发现,与癌旁肺癌组织相比,ENO1在非小细胞肺癌组织中的表达量明显减少;Zhou等研究发现,在A549细胞中过表达ENO1基因,导致上皮样标志物E-cadherin表达上调,但是间质样标志物N-cadherin和Vimentin表达是下降的,而且,TGFβ-1诱导实验也证实了 ENO1对非小细胞肺癌细胞的EMT进程有抑制作用,提示ENO1在非小细胞肺癌细胞发挥着抑癌作用。因此,ENO1在非小细胞肺癌中的表达仍存在争议,而且,其在非小细胞肺癌中的具体功能和参与调节的机制均不明确。上皮间质转换(EMT)的概念是1968年Elizabeth Hay提出的,指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。EMT过程在恶性肿瘤的转移中起到重要作用。发生EMT时,间质样细胞通常丢失E-cadherin和ZO-1等上皮样细胞表面分子,而获得间质样细胞标志N-cadherin和Vimentin,并伴随着转录因子Twist、Snail和Slug的上调。在我们的研究中,我们发现ENO1能使N-cadherin、Vimentin和Snail的表达水平增加,使E-cadherin的表达水平下降,说明ENO1能通过调控EMT相关蛋白的表达来促进非小细胞肺癌细胞的侵袭转移。EMT 是 PI3K/AKT、Wnt、NF-κB、Hedgehog、TGFβ、ERK 和Notch等信号通路参与的生物学过程。磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信号通路参与细胞的生长、增殖和侵袭转移等功能的调节,是一个重要的信号通路。Akt是PI3K/AKT信号通路的核心,研究发现活化AKT可调节细胞的生物学功能。FAK是PI3K/AKT信号通路的一个重要的上游分子,已证实FAK磷酸化激活后可激活PI3K/AKT信号通路,从而引起其下游信号的改变,进而触发生物学功能。CD133是一种跨膜糖蛋白,有研究证实CD133在细胞表面的表达下调细胞分化。目前CD133已作为识别肿瘤干细胞(CSC)的一个标记物广泛应用于结肠癌,脑癌,肺癌,胰腺癌等癌症。在许多研究中发现了 CD133在癌症中的预后价值。基于ENO1和CD 133在肺癌中的研究现状,本课题的研究目的是明确ENO1在非小细胞肺癌组织中的表达情况,及其在非小细胞肺癌中的功能,并进一步探讨ENO1参与非小细胞肺癌调节的信号转导通路,为研究NSCLC的发生发展提供分子机制;明确ENO1表达与小细胞肺癌的相关性,明确CD133表达与非小细胞肺癌的相关性;同时为肺癌的治疗提供新的思路。研究内容与方法1.ENO1在非小细胞肺癌临床样本中表达情况及表达定位的鉴定(1)收集云南医科大学第三附属医院外科收治的55例非小细胞肺癌临床样本及17例正常肺组织制作石蜡切片,同时收集26例新鲜的均经过病理确诊的非小细胞肺癌组织、癌旁组织和正常组织(远离癌灶边缘5cm),所有组织液氮保存;(2)提取26例新鲜非小细胞肺癌、癌旁组织及其正常组织样本的总RNA,然后逆转录成cDNA,以ARF5作为内参,运用实时荧光定量PCR检测ENO1的相对表达量;(3)用免疫组织化学法对55例非小细胞肺癌和17例正常肺组织的ENO1表达行定位分析和定量分析,将ENO1表达情况进行统计分析;(4)利用荧光定量PCR和Western blot分别检测ENO1在非小细胞肺癌细胞株A549、SPCA-1和非癌细胞株HBE中的mRNA和蛋白水平;(5)使用免疫荧光分别检测ENO1在非小细胞肺癌细胞株A549和SPCA-1中的表达及定位情况。2.ENO1在非小细胞肺癌细胞中的功能研究(1)运用插入ENO1CDS区的慢病毒感染A549细胞,建立稳定过表达ENO1的A549细胞株;采用荧光定量PCR和Western blot鉴定过表达效果;(2)用慢病毒载体稳定干扰SPCA-1中ENO1的表达,行实时荧光定量PCR,Western blot检测其干扰效率;(3)稳定下调ENO1后采用MTT实验检测A549和SPCA-1细胞增殖的变化;过表达ENO1后,采用MTT实验检测A549和SPCA-1细胞增殖的变化;(4)稳定下调或过表达ENO1后,采用平板克隆形成实验检测A549和SPCA-1细胞的克隆形成情况;(5)稳定下调或过表达ENO1后,采用Transwell和Boyden实验检测A549和SPCA-1细胞的侵袭和细胞迁移能力的改变;(6)稳定下调或过表达ENO1后,裸鼠皮下成瘤实验检测NSCLC细胞体内成瘤和增殖能力的改变。3.ENO1在NSCLC中促进增殖、侵袭及转移的分子机制(1)稳定下调或过表达ENO1后,采用Western blot检测细胞增殖、EMT通路相关蛋白的改变,及PI3K/Akt通路相关蛋白的变化情况;(2)稳定下调或过表达ENO1引起PI3K/Akt通路相关蛋白变化后,采用Western blot检测FAK蛋白的变化情况;(3)人血管紧张素II处理干扰ENO1的SPCA-1细胞后,Western blot检测FAK、PI3K/Akt及下游相关蛋白的变化。4.ENO1与小细胞肺癌相关性的Meta分析5.CD133与非小细胞肺癌相关性的Meta分析结果1.ENOl在非小细胞肺癌中高表达采用实时荧光定量PCR方法对收集的26例新鲜的非小细胞肺癌组织、癌旁组织及其正常组织进行检测,测ENO1在NSCLC和对照非癌组织中的表达情况。与非癌肺组织相比,非小细胞肺癌组织中ENO1mRNA表达水平明显增高(P<0.05)。随后运用免疫组织化学技术检测了 55例非小细胞肺癌临床样本及17例正常肺组织中ENOl的表达和定位,结果示:ENOl在细胞浆和细胞核中均有表达,但主要位于细胞浆中,由于我们使用的抗-ENO1抗体是非特异性抗体,能同时检测到胞浆中的ENOl和胞核中的MBP-1,但本研究主要是为了研究ENOl,故该研究只对胞浆定位的ENOl进行评估,其在非小细胞肺癌组织中的表达较正常肺组织上调(P<0.05)。通过细胞免疫荧光检测发现,ENOl主要定位于A549和SPCA-1的细胞质中,胞核(MBP-1)几乎不表达。我们通过实时荧光定量PCR方法检测A549和SPCA-1两株肺癌细胞和正常肺支气管上皮细胞HBE中ENOl mRNA的表达情况,结果表明,两株肺癌细胞中的ENOl mRNA较正常肺支气管上皮细胞HBE表达水平高(P<0.05)。运用Western blot检测A549、SPCA-1和HBE细胞中ENOl的表达情况表明,比起正常肺支气管上皮细胞HBE,两株肺癌细胞中ENOl的表达上调。2.稳定过表达ENOl可以促进肺癌细胞的增殖、克隆形成和体内成瘤能力运用插入ENOl CDS区的慢病毒感染A549细胞,建立稳定过表达ENOl的A549细胞株,用实时荧光定量PCR和Western blot检测均表明ENOl在A549中过表达成功。在稳定过表达ENOl后,对过表达ENOl的A549细胞进行MTT法检测,观察其体外存活能力。结果为:稳定过表达ENO1后,细胞的增殖能力较对照组相比增强,生长显著增快(P<0.05)。随后采用平板克隆形成实验检测过表达ENO1后A549细胞的克隆形成能力,结果表明,稳定过表达ENO1后,细胞形成克隆的能力增强(P<O.O5)。为了进一步观察ENO1对体内肿瘤的影响,我们采用裸鼠皮下成瘤实验检测稳定过表达ENO1后A549细胞的成瘤能力发现,与注射对照细胞的裸鼠相比,注射稳定过表达ENO1后A549细胞的裸鼠的皮下肿瘤更大更重(P<0.05),表明稳定过表达ENO1可以促进肺癌细胞的体内成瘤能力。3.稳定过表达ENOl可以促进肺癌细胞的侵袭及转移能力稳定过表达ENO1后,进行的Transwell体外侵袭实验和Boyden体外迁移实验结果显示,上调ENO1的表达后,A549的穿膜细胞数增多(P<0.05)。说明ENO1可促进NSCLC细胞的侵袭和转移。4.稳定干扰ENOl表达可以抑制细胞增殖、克隆形成和体内成瘤能力在SPCA-1中应用3个不同的shRNA慢病毒载体干扰ENO1的表达,用实时荧光定量PCR和Western blot技术分别检测ENOl mRNA和蛋白水平来验证干扰效率,筛选出干扰效率较好的片段。实时荧光定量PCR的结果表达,shENOl的B和C片段对SPCA-1干扰效率较A更好(P<0.05)。Western blot技术检测的蛋白水平变化与实时荧光定量PCR的结果相符。保留干扰效率较好的B和C片段,用于后续实验的开展。建立稳定干扰ENO1的SPCA-1后,对细胞增殖的变化进行了检测。MTT实验结果表明,稳定干扰ENO1后,SPCA-1的生长速度明显较对照组慢(P<0.05)。平板克隆实验的结果显示,干扰ENO1后SPCA-1的克隆形成能力明显降低。裸鼠皮下成瘤实验表明,与对照组相比,稳定干扰ENO1的裸鼠的皮下肿瘤更小更轻(P<0.05),表明稳定过干扰ENO1可以抑制肺癌细胞的体内成瘤能力。5.稳定干扰ENOl可以抑制肺癌细胞的侵袭及转移能力稳定干扰ENO1后,进行的Transwell体外侵袭实验和Boyden体外迁移实验结果示,下调ENO1的表达后,SPCA-1的穿膜细胞数减少(P<0.05)。这说明稳定干扰ENO1可以抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭和转移。6.ENOl调控了细胞周期和EMT相关基因的表达为了进一步验证ENO1影响细胞增殖、侵袭及迁移的机制,我们用Western blot方法检测了稳定过表达ENO1的A549和稳定干扰ENO1的SPCA-1细胞中的相关蛋白表达情况。结果显示,稳定干扰ENO1抑制了细胞周期相关蛋白p-Rb(Ser 780)、c-Myc、CyclinDl和CyclinEl的表达,激活了p21的表达;此外,稳定干扰ENO1也抑制了EMT相关蛋白Snail、Vimentin和N-cadherin的表达,而激活了上皮标志物E-cadherin的表达。在稳定过表达ENO1的A549细胞中,相关蛋白表达情况与之恰好相反。7.ENOl 调控FAK/PI3K/AKT通路PI3K/AKT是细胞内重要的信号通路之一,可以参与调控细胞周期和EMT。通过Western blot,我们检测了ENO1对PI3K/AKT通路的影响。结果发现,稳定干扰ENO1后,磷酸化的PI3K和AKT的表达明显下调,而总PI3K和AKT的表达无明显变化,转录因子β-catenin的表达也明显下调。在稳定过表达ENO1的A549细胞中,相关蛋白表达情况与之恰好相反。由此可看出,ENO1调控了PI3K/AKT信号通路。FAK是PI3K/AKT信号通路的一个上游分子,我们随后检测了FAK蛋白的变化,发现稳定干扰ENO1后,磷酸化FAK的表达明显下调,而非磷酸化FAK的表达无变化,在过表达ENO1的A549细胞中,结果与之相反。由此可以推论,ENO1也许是通过激活FAK来调控PI3K/AKT信号通路的。多项研究均表明人血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)能够激活磷酸化FAK的表达而不影响非磷酸化FAK的表达。于是,我们引入了Ang Ⅱ来处理干扰ENO1后的SPCA-1细胞,，Western blot检测Ang Ⅱ处理后的蛋白发现,Ang Ⅱ能够部分逆转干扰ENO1引起的磷酸化FAK和AKT的下调,但其总蛋白水平未发生明显变化,同时也部分逆转了 CyclinDl、c-Myc、p21和β-catenin的表达。这些结果表明ENO1是FAK/PI3K/AKT通路上游的调控因子并可调节该通路。8.ENO1与小细胞肺癌相关性的Meta分析应用Meta分析探讨了 ENO1表达与小细胞肺癌相关性,分析结果显示ENO1表达与小细胞肺癌是不相关的。9.CD133与非小细胞肺癌相关性的Meta分析CD133是CSC的一个标记物,应用Meta分析探讨了 CD 133表达与非小细胞肺癌的相关性,分析结果显示:CD133阳性表达与非小细胞肺癌的细胞低、中分化和淋巴结转移是相关的。结论ENO1在非小细胞肺癌组织中高表达,与非癌细胞相比,ENO1在非小细胞肺癌细胞中也高表达。细胞功能学实验表明,ENO1可以促进非小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭和转移。机制研究表明,ENO1可以通过调控细胞周期相关蛋白 p-Rb(Ser780)、c-Myc、CyclinDl、CyclinEl 和 p21 的表达来促进非小细胞肺癌细胞的增殖;此外,ENO1还可以通过调控EMT相关蛋白Snail、Vimentin、N-cadherin和E-cadherin的表达来促进非小细胞肺癌细胞的侵袭和转移。而且,进一步的机制研究表明,ENO1调控非小细胞肺癌的增殖和侵袭转移是通过激活FAK介导的PI3K/AKT通路来实现的。Meta分析表明,ENO1表达与小细胞肺癌是不相关的,CD133阳性表达与非小细胞肺癌的细胞低、中分化和淋巴结转移是相关的。我们认为ENO1和CD133可能为非小细胞肺癌治疗未来研究的新靶点。