论文部分内容阅读
香樟树是重要的园林景观树木,因其四季常绿、枝叶清香等优点,被广泛种植。樟巢螟(Orthaga achatina Butler)是樟树重要害虫,随着樟树种植范围的扩大,樟巢螟的发生和为害也日趋严重。樟巢螟幼虫的结苞危害习性,导致传统的化学防治的效果并不理想,加之景观树种上害虫无公害防治的特殊要求,需要开发并应用更为高效的环境友好防治技术。昆虫性信息素技术已在很多害虫,特别是蛾类害虫的防治中得到应用,有望应用于樟巢螟的无公害防治中,但相关研究尚属空白。本实验室从2009年起开展樟巢螟性信息素鉴定及其应用技术研究,系统观察了樟巢螟成虫的交配行为以及触角上感器的类型及分布,并初步鉴定了一个性信息素组分。在此基础上,本文进一步鉴定了樟巢螟的其余性信息素组分,并据此配制性信息素诱芯进行了田间诱蛾试验；同时,为了探讨樟巢螟的嗅觉机制,并为高效嗅觉干扰剂的开发提供潜在的靶标基因,本文还对樟巢螟的2个气味结合蛋白(Odorant binding protein,OBP)基因进行了克隆和功能分析。主要结果如下：1樟巢螟雌蛾性信息素组分的鉴定运用气相色谱法(GC)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)从樟巢螟雌蛾性信息素腺体中鉴定出3个组分：Z11-16:Ac、E11-16:OH和Z9-16:OH。利用二甲基二硫醚(DMDS)甲硫基化反应和GC-MS进行了双键定位分析,证实了Z11-16:Ac和El1-16：OH的双键位置,而Z9-16:0H由于含量较其双键位置低没有得到证实,待进一步验证。2樟巢螟对气味物质EAG及行为反应测定利用触角电位(EAG)技术,测定了樟巢螟对3种性信息素组分和20种植物挥发物的电生理反应。结果表明,3种性信息素组分均能引起樟巢螟雄虫触角明显的EAG,其中以Z11-16：Ac引起的反应明显较大；樟巢螟触角对20种植物挥发物均有反应,且大小趋势在雌雄间基本一致,反应较强的有顺-3-己烯醇丁酸酯、芳樟醇、己醇、醋酸己酯、樟脑5种植物挥发物。根据信息素鉴定及EAG测定结果,配制诱芯进行田间诱捕实验表明,3、6、7、N7号4种诱芯均显示一定的诱蛾活性；两种诱捕器比较发现,水盆诱捕器效果较好,干式诱捕器没有效果。3樟巢螟气味结合蛋白基因的克隆及表达谱分析根据已发表的昆虫信息素结合蛋白(Pheromone binding protein, PBP)和普通气味结合蛋白(General odorant binding protein, GOBP)基因序列设计兼并引物,利用RT-PCR和RACE技术从樟巢螟雄虫触角中分别克隆到1个PBP和1个OBP基因,分别命名为OachPBPl和OachGOBP2.进一步利用实时定量PCR技术分析2个基因在樟巢螟不同组织及雌雄触角间的表达差异,发现OachPBP1和OachGOBP2都只在雌雄触角中表达; OachPBP1在雄虫触角中的表达量明显高于雌虫触角,前者是后者的3.9倍,但OachGOBP2在雌雄触角间无显著差异。4樟巢螟PBP1和GOBP2的原核表达及配体结合能力将两个OBP基因构建到pET-30a(+)表达载体中,在大肠杆菌中经IPTG诱导后得到成功表达,然后利用镍离子亲和层析法和肠激酶酶解得到纯化的蛋白。在此基础上,采用荧光竞争结合实验测定了2种OBP对樟巢螟性信息素组分及其类似物以及植物挥发物的结合能力。结果表明,OachPBP1对13种性信息素组分及其类似物均有很强的结合能力,说明OachPBP1可能参与了性信息素组分的识别和运输；OachGOBP2除与一些植物挥发物结合外,与3种性信息素组分也有很高的结合能力(与OachPBP1类似),推测OachGOBP2不但参与植物挥发物而且还可能参与性信息组分的嗅觉过程；此外,法呢醇和法呢烯与OachPBP1和OachGOBP2均具有较强的结合能力,暗示这两种物质或其类似物在樟巢螟的嗅觉行为中起作用。