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背景:胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)是一种常常出现在胃肠道以及腹部的间质肿瘤,免疫组化染色时其KIT通常呈阳性,同时也是胃肠道间叶组织肿瘤的常见类型。GIST多数出现在胃部,其比例达到约60%～70%,食管部位比例达到约2-3%,在小肠部位,其比例达到约25%～35%,阑尾以及结直肠部位的比例达到约5%。从组织学角度,GIST主要包括上皮样细胞以及梭形细胞,依据上皮样细胞以及梭形细胞所占比例,GIST可分成上皮样细胞型、混合型和梭形细胞型,其形态多与肿瘤位置相关。在台湾,香港以及上海等地区,GIST发病率相对较高,且将近50%的患者发现时已发展至中晚期。GIST好发于中老年人,患者年龄通常在60～65岁之间,很少发生于40岁以下人群,只有不到1%会发生在年龄小于21周岁的人群。直肠、食道与胃等部位GIST恶性程度相对不高,而结肠以及小肠部位GIST恶性程度相对不低。GIST患者总体生存率约35%(5年),肿瘤完全切除的GIST患者总体生存率约50～65%(5年),而不能切除的GIST患者的生存期低于1年,其中食道部位的GIST患者预后效果最佳,而小肠部位的肿瘤患者的预后效果最差。受体酪氨酸激酶信号通路,特别是PDGFRA以及KIT信号通路的不断激活是导致GIST的重要驱动因素,然而Wnt/β-Catenin信号通路,丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor,IGF)Ⅱ 信号通路,Hedgehog 信号通路和 PI3K-AKT信号通路等在GIST发生发展和多重耐药性方面发挥至关重要作用。多项研究显示,过度激活PI3K-AKT信号通路和GIST恶性程度较高和预后较差相关,同时GIST细胞的PI3K-AKT信号通路过度激活时,其对伊马替尼以及舒尼替尼的耐药性更高。MicroRNA(miRNA)是一种内源性的非编码的单链RNA(长度为20-22个核苷酸的)。miRNA大部分能够调节靶基因表达而发挥调控作用。通过生物信息学的分析,miRNA大约调节了>50%的人类基因的表达。2002年,Calin等人首先发现了 miRNA表达的变化与肿瘤发生发展之间的关系,随后越来越多的研究表明,在肿瘤发生发展的过程中,miRNA表达谱存在明显的改变。在GIST中,miRNA表达的改变通常会调节GIST细胞的生长增殖,转移,预后以及对治疗的敏感性。目前已经有多种miRNA如miR-376c-3p、miR-494、miR-218被鉴定并被证明参与GIST细胞增殖、细胞侵袭、凋亡以及细胞迁移等生物学过程。Kim等学者研究表明,在GIST细胞中,miR-494是kit蛋白的负调节因子,miR-494的过度表达引起GIST细胞凋亡同时对肿瘤细胞的生长产生抑制,同时伴随着G(1)和S相含量的变化。miR-22最早在Hela细胞中被发现,后续研究显示miR-22广泛分布在各器官组织中。进化分析表明,miR-22在脊椎动物中保守性相对较高,在小鼠以及人类的基因组中,miR-22基因都存在于与肿瘤发生、发展密切相关的基因区域。已有研究表明miR-22在肿瘤的发生和发展,预后判断以及调节癌细胞对药物的应答方面发挥重要的作用。如李朝阳等通过生物信息学方法发现miR-22-3p在低级胶质瘤、乳头状肾细胞癌以及肺鳞状细胞癌等肿瘤中存在异常表达,进一步分析发现miR-22-3p和患者的总体生存率密切相关。Fan等研究发现,小檗碱导致miR-22-3p水平升高从而抑制SP1表达,进而抑制肝细胞癌细胞的增殖并促进其凋亡,从而有利于肝细胞癌的治疗。因此,肿瘤细胞给予化疗药物治疗时上调miR-22-3p表达有助于提高肿瘤细胞杀手效果。然而miR-22在GIST中的作用鲜有报道。目前,治疗GIST最彻底以及最有效的治疗手段为手术切除,同时化疗同样也是一种重要的辅助手段。目前临床上应用较好的药物是受体酪氨酸酶抑制剂,例如伊马替尼及舒尼替尼,二者能够显著提高GIST患者的预后。但对酪氨酸酶抑制剂的耐药性也是目前临床上所面临的较大的问题。因此寻找新的可替代的药物具有重要意义。顺铂是一种在临床上广泛应用于实体瘤治疗的非靶向化疗药物,其通过结合DNA,引起DNA的交叉联结,从而诱导细胞死亡,其在卵巢癌,子宫内膜癌,前列腺癌,乳腺癌,肺癌等多种实体肿瘤中疗效效果明显,但是在GIST临床治疗中效果不佳,因此,在本研究中,我们期望通过探究miR-22-3p对GIST细胞对顺铂敏感性的影响,以期为治疗GIST寻找到新的有效治疗靶标和药物。目的:探究miR-22-3p在调节GIST细胞对顺铂敏感性中的作用。方法:首先,在GIST-T1细胞(GIST细胞系)中转染miR-22-3p mimics,并通过qRT-PCR实验验证GIST-T1细胞中miR-22-3p的表达。接着通过CCK-8实验探究miR-22-3p对GIST细胞生长活性的作用。同时在GIST-T1细胞中过表达miR-22-3p,再用顺铂处理24小时后分别检测空白对照组,单用miR-22-3p mimics处理组,单用顺铂处理组以及miR-22-3p mimics和顺铂联合处理组中GIST-T1细胞的存活。进一步我们将各处理组细胞进行Annexin V/PI双染,然后采用流式细胞术检验GIST-T1的细胞凋亡率并且利用western blot技术检测各组种类细胞凋亡蛋白水平变化。接着,通过细胞划痕实验来检测miR-22-3p对GIST细胞迁移的影响。我们在GIST-T1细胞中过表达miR-22-3p并用顺铂进行处理,然后用10 μl的无菌枪头划过细胞制造划痕,24小时后观测各组GIST-T1细胞的迁移情况。为探究miR-22-3p调节GIST细胞对顺铂敏感性的信号通路,我们通过western blot以及qRT-PCR实验检测各组肿瘤细胞中PTEN蛋白及其mRNA水平,同时利用western blot检测了各处理组细胞内PTEN/PI3K/AKT信号通路中其他蛋白,例如PI3K和AKT的蛋白水平。结果:qRT-PCR实验表明转染miR-22-3p mimics的 GIST-T1细胞中 miR-22-3p水平明显高于转染空白miRNA mimics的对照细胞(P<0.01),约高出67.93 ±8.81%。CCK-8实验表明过表达miR-22-3p的肿瘤细胞的存活率达到80.13 ±8.25%,比对照组显著低(P<0.05);顺铂处理的肿瘤细胞存活率达到77.98 ±6.82%,同样比对照组显著低(P<0.05);而在同时用miR-22-3p mimics和顺铂处理的细胞的存活率为59.27 ±6.09%,与对照组相比结果有显著性差异(P<0.01),同时和单用顺铂或单用miR-22-3p mimics处理的肿瘤细胞相比,器结果同样也存在显著性差异(P<0.05)。流式细胞术结果表明,与4.3%的对照组凋亡率相比,单用miR-22-3p mimics(20.9%)或顺铂处理(23.0%)都可以显著促进GIST-T1细胞的凋亡,而同时用miR-22-3p mimics和顺铂处理组的细胞凋亡率为33.6%,显著低于对照组、单用miR-22-3p mimics处理组和顺铂处理组,比较存在显著性差异(P<0.05)。在单转miR-22-3p mimics(67.63±7.1 1%)和单用顺铂处理过的GIST-T1细胞中(62.44± 6.52%),Bcl-2/Bax比率显著减少(P<0.05),在顺铂以及miR-22-3p mimics共同处理肿瘤中,该比率进一步降低,比较存在显著性差异(P<0.01)。与凋亡相关的另一蛋白caspase-3在单转miR-22-3p mimics(增加21.5 ± 2.01%)和单用顺铂处理过的GIST-T1细胞(增加33.62 ± 9.59%)中表达显著高于对照组(P<0.05),在miR-22-3p mimics和顺铂共同处理组中,与空白对照相比,caspase-3表达水平进一步明显增加(P<0.01),约增加69.37 ± 5.08%,同时与单转miR-22-3p mimics或单用顺铂处理组相比,caspase-3表达的增加也具有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕显示,与52.53 ±2.12%的空白对照相比,过表达miR-22-3p(49.8±2.1%)和单用顺铂(44.6±2.11%)能够显著减少GIST-T1细胞迁移,而在顺铂以及miR-22-3p mimics共处理组中(36.5±1.98%),GIST-T1细胞的迁移进一步被抑制。通过qRT-PCR实验我们发现过表达miR-22-3p和顺铂处理可以增加胞内PTEN mRNA水平,比较存在显著性差异(P<0.05),而用miR-22-3p mimics和顺铂共处理可以进一步增加PTEN mRNA水平,比较存在显著性差异(P<0.01),同时与单转miR-22-3p mimics和单用顺铂处理的细胞相比,共处理组PTEN mRNA水平的增加存在显著差异(P<0.05),随后通过western blot检测AKT,PI3K以及PTEN水平。与mRNA结果一致的是,在单转miR-22-3p mimics组和单用顺铂处理组中,PTEN的蛋白水平显著高于对照组(P<0.05),且miR-22-3p可以进一步增强顺铂对PTEN蛋白表达的促进作用。同时,miR-22-3p mimics或顺铂处理可以降低PI3K和AKT蛋白表达水平,比较存在显著性差异(P<0.05),而miR-22-3p可以进一步增强顺铂对AKT和PI3K蛋白水平的抑制作用。结论:1.miR-22-3p增强顺铂对GIST细胞生长活性的抑制;2.miR-22-3p增强顺铂对GIST细胞凋亡的促进作用;3.miR-22-3p增强顺铂对GIST细胞迁移的抑制作用;4.miR-22-3p可能对PTEN/PI3K/AKT信号通路蛋白水平的调控而增加GIST细胞对顺铂的敏感性的。