论文部分内容阅读
目的:探讨程序性坏死特异性抑制剂-1(Necrostatin-1,Nec-1)抑制创伤失血性休克大鼠肝脏炎症因子的影响及其分子生物学机制。内容:本实验分为两个部分,第一部分:采用创伤失血性大鼠休克模型,将30只雄性SD大鼠利用随机数字发生器分为假手术组、DMSO组、Nec-1组,每组10只。假手术组不行钳夹断肢及失血操作和液体回输,仅进行腹腔水合氯醛麻醉、剥离左颈动脉、结扎左颈动脉。DMSO组建立创伤失血性休克大鼠模型,并回输血液及液体,再灌注前5 min前股静脉给予DMSO溶剂。Nec-1组建立创伤失血性休克大鼠模型,并回输血液及液体,再灌注前5 min股静脉给予Nec-1,1 mg/kg。再灌注后24 h各处死动物10只,取动物血清及肝脏组织。检测血清中各时间点ALT、AST水平;HE染色观察肝脏病理变化;Tunel法检测24h后肝组织内细胞凋亡情况;透射电镜观察再灌注后24 h后细胞器水平的细胞坏死;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测24h后肝脏组织中巨噬细胞炎性蛋白-1α(Macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)m RNA、单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)m RNA含量。酶联免疫分析法(ELISA)分析24h血清中MIP-1α、MCP-1含量。第二部分:采用创伤失血性大鼠休克模型,将96只雄性SD大鼠利用随机数字发生器随机分为假手术组、DMSO组、Nec-1组,每组32只。假手术组不行钳夹断肢及失血操作和液体回输,仅进行腹腔水合氯醛麻醉、剥离左颈动脉、结扎左颈动脉。DMSO组建立创伤失血性休克大鼠模型,并回输血液及液体,再灌注前5 min前股静脉给予DMSO溶剂。Nec-1组并回输血液及液体,再灌注前5 min股静脉给予Nec-1,1mg/kg。再灌注后分别在2h、8h、16h、24h各处死动物8只,取动物血清及肝脏组织。检测血清中ALT、AST水平;HE染色观察肝脏病理变化;酶联免疫分析法(ELISA)分析血清中HMGB-1(high mobility group B1,HMGB-1)含量;蛋白质免疫印迹法(Western Blotting)分别检测肝脏组织中胞浆和总蛋白的HMGB-1含量;蛋白免疫印迹法检测肝脏组织中RIP3蛋白的含量。结果:第一部分:在制备模型后24h,DMSO组和Nec-1组中肝脏结构遭到破坏,光镜下模型组及DMSO组可见肝细胞气球样变,小叶结构布局杂乱,淤血,炎性细胞浸润明显,Nec-1组肝组织损伤明显减轻。透射电镜DMSO组下可见细胞膜结构尚可,胞质内线粒体数量溶解、嵴消失、减少,内质网数量减少,溶酶体增多,脂滴增多,染色质出现粗颗粒,Nec-1组中损伤较DMSO组减轻。Tunel检测显示DMSO组与Nec-1组中凋亡细胞情况并无明显差异(P>0.05)。Nec-1组中24h血清ALT(248.05±67.55、127.2±20.04比73.46±23.75)、AST(823.74±89.04、416.67±100.46比236.36±67.79)及血清MIP-1α(0.249±0.149、0.182±0.099比0.063±0.026)、MCP-1(981.519±60.483、714.424±55.092比310.517±15.877)含量与模型组及DMSO组比较,有明显下降(P<0.05)。Nec-1组中肝脏组织MIP-1αm RNA(7.134±2.811、2.924±1.153比1.000±0.000)、MCP-1m RNA(7.319±0.517、5.554±0.435比1.000±0.000)与DMSO组比较,有明显下降(P<0.05)。第二部分:Nec-1组与DMSO组比较,血清8h、16h、24h中ALT、AST及HMGB-1含量有显著差异(P<0.05);光镜下DMSO组及Nec-1组可见肝脏结构遭到破坏,光镜下模型组及DMSO组可见肝细胞气球样变,小叶结构布局杂乱,淤血,炎性细胞浸润明显,Nec-1组肝组织损伤明显减轻;与DMSO组相比,Nec-1组肝细胞中胞浆蛋白HMGB-1在8h(0.025±0.003、0.184±0.007比0.124±0.013)、16h(0.022±0.004、0.400±0.019比0.318±0.030)、24h(0.022±0.003、0.341±0.051比0.245±0.014)有明显下降(P<0.05),Nec-1组总蛋白HMGB-1在8h(1.010±0.042、1.348±0.046比1.298±0.073)、24h(1.053±0.048、1.438±0.634比1.374±0.060)有明显下降(P<0.05)。Nec-1组中RIP3蛋白含量在8h(0.169±0.023、0.673±0.042比0.543±0.126)、16h(0.178±0.022、1.044±0.115比0.836±0.090)、24h(0.186±0.023、1.446±0.141比1.266±0.128)有明显下降。结论:1.Nec-1可以有效降低创伤失血性休克对肝脏的损伤,减少MIP-1α、MCP-1蛋白的表达,减少免疫细胞对组织的浸润及破坏。2.Nec-1可以有效降低创伤失血性休克对肝脏的损伤,减少HMGB-1的释放,减少RIP3蛋白的产生,有效保护肝细胞。