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抗生素耐药性问题是全球公共卫生领域当前面临的主要威胁之一,研发与已知抗生素缺少交叉耐药性的新型药物是持续的社会需求。放线菌作为主要的小分子药物来源一直备受到天然产物化学家的青睐,几十年来,尽管放线菌的分离方法并未发生根本性的变革,但放线菌天然产物的研究已经由传统的活性指导为主的发现方式逐渐变革为基因(簇/组)序列指导为主的发现方式,序列指导发现新天然产物使得其生物合成研究的开展变得顺理成章,生物合成研究获得的新知识反过来又可以促进天然产物的理性发现,形成良性循环,有望引起天然产物研究的再次复兴。本论文从土壤放线菌选择性分离与优选、两株高新颖性菌株的基因组挖掘和挖掘产物的生物合成三方面开展了系统的研究。通过放线菌的选择性分离和去重复,我们从来自全国各地的55份土壤样品中分离获得了 779株放线菌,其中稀有放线菌276株,占比35.4%。通过PCR筛选兼具保守性和特异性的AHBA合酶基因,我们共获得了 54株AHBA合酶基因阳性菌(S001-S054),部分菌株由于保存后未能成功复苏,实际获得AHBA 阳性菌44株。我们从中挑选了 AHBA合酶基因新颖性最高的两株链霉菌S001和S006进行了基因组测序,开展进一步的天然产物挖掘工作。基因组扫描显示Streptomyces sp.S006基因组大小约8.07 Mb,该菌的AHBA合酶基因位于基因组中唯一的典型安莎基因簇中,课题组其他同学尝试对该基因簇进行激活未果,进一步的分析提示,尽管该基因簇的AHBA合酶序列新颖,但基于酰胺合酶的进化分析显示其产物很可能为已知安莎rubradirin,因此,我们放弃了该基因簇。然而,使用安莎加载结构域检索时,我们发现S006中存在一个与安莎具有进化关联的Ⅰ型-Ⅲ型聚酮杂合基因簇(后命名为vemS006),推测其起始单元与AHBA结构类似。通过过表达LAL家族调控基因vemR,我们成功激活了该基因簇,通过扩大发酵和追踪分离,分离鉴定了其产物venemycin(2)及其氯代新结构衍生物2-chloro-venemycin(1)。VemS006基因簇中存在两个黄素依赖卤代酶(Flavin-Dependent Halogenase,FDH)基因vemJ/K和一个可能起辅助作用的黄素还原酶(Flavin Reductase,FR)基因vemL。我们首先尝试使用CRISPR/cas9技术对vemJ/K进行敲除,其中vemK未能获得敲除株,vemJ敲除后化合物1的合成并不受影响。因此,我们改变策略,尝试通过VemJ/K/L蛋白的异源表达和生化表征来研究其卤代过程。一系列的体外生化实验表明,VemK负责venemycin(2)的卤代,不过令人意外的是,在没有黄素还原酶VemL的情况下,VemK仍然能够高效地催化卤代反应。与多数卤代酶相同,VemK可以同时催化氯代和溴代,氯代时,VemK对venemycin的kcat值为 0.209±0.007 min-1,Km 值为 0.616±0.075 μM,kcat/Km值为 0.3397 μM-1.min-1,而催化溴代反应时,VemK对venemycin的kcat值为0.139±0.004 min-1,Km值为0.515±0.058 μM,kcat/Km值为0.2707 μM-1.min-1,结果显示VemK更倾向于向venemycin的吡喃酮环上引入氯原子。令人意外的是,VemJ虽然无法直接催化venemycin(2)的卤代,但其存在的情况下,可以在一定程度上提高VemK的催化活性。由于VemK是一类新颖的单组份卤代酶,我们通过同源建模和分子对接尝试寻找其可能存在的隐藏FR功能域,定点突变实验揭示了两个氨基酸残基T315和R317很可能通过与NADH结合在VemK的FAD/FADH2再生循环中发挥着关键作用。Streptomyces sp.S001分离自青岛崂山土样,该菌基因组大小为10.43 Mb,含有27条典型的次级代谢基因簇。我们使用多种激活策略对该菌中可能编码新天然产物的基因簇进行了操作,但未能实现定向激活。有意思的是,在对sm1、sm5进行调控基因过表达和在sm25中插入ermEp*强启动子时,均意外激活了sm8,获得了新化合物SRT-A1(5),从结构上判断SRT-A1可能是Ⅲ型聚酮产物1,3,6,8-四羟基萘(1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene,THN)的二聚化产物。敲除sm8-P450基因终止了 SRT-A1合成并在13.8 min处积累了分子量为194.0796的新产物(与THN分子量相差2),说明该P450酶可能参与了二聚化过程,目前,这一可能的中间产物还在分离鉴定中。在进行SRT-A1生物合成研究的过程中,我们还鉴定了 Ⅱ型聚酮基因簇sm3的新骨架芳香聚酮产物SRT-A7(6)。综上所述,我们通过对55份土样的选择性分离,建立了一个包含779株放线菌的菌种库,其中AHBA合酶基因阳性菌44株,对序列新颖程度最高的S001和S006进行了产物挖掘,从S006中鉴定了 venemycin(2)及其新结构衍生物2-chloro-venemycin(1),从 S001 中鉴定了新化合物 SRT-A1(5)和 SRT-A7(6)。通过生物合成研究,从VemS006基因簇中鉴定并详细表征了新颖的单组份FDH卤代酶VemK,VemK是链霉菌中首个单组份FDH,同时也是首个催化吡喃酮卤代的FDH。对S001中发现的两类新化合物,我们也开展了初步的生物合成研究。总体来看,放线菌甚至是许多链霉菌中仍存在大量新颖的次级代谢途径,可能合成新天然产物,但如何有有效地释放这些合成潜力仍然面临着诸多挑战。本论文开展的天然产物定向挖掘成功率不高,未来还需要应用或开发更多/更有效的激活方法开展进一步的工作。