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醇脱氢酶作为重要的氧化还原酶,可以催化羰基类的化合物还原生成手性醇,而手性醇又是很多药物合成的关键中间体。(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)是合成降胆固醇药物lipitor的重要中间体,它可以由β-酮类物质催化还原生成。我们在研究中发现Lactobacillus plantarum的全细胞可以催化A7的合成。本文以L.plantarum为研究对象,对其基因组DNA编码的醇脱氢酶进行系统研究。首先,根据已知短链和中链脱氢酶的保守氨基酸序列设计兼并引物进行PCR扩增,得到中间序列后,采用hiTAIL-PCR方法扩增出其两边序列,共获得了五种不同类型的脱氢酶基因。应用Blast进行核酸序列比对,结果显示其中两种为短链脱氢酶(分别命名为1s,3s),其它三种为中链脱氢酶(分别命名为2m,3m,4m)。其后发现该菌株基因组序列已知,我们便参考相关文献后,从中挑选出对β-酮类物质可能有活性的五种不同类型的脱氢酶,包括两种短链脱氢酶(1s,3s),一种中链脱氢酶(2m),两种醇脱氢酶(1a,2a),并把相关基因分别克隆到表达载体pBAD和pEASY-E1上,成功构建了MC1061-pBAD-3s,TransB(DE3)-pEASY-E1-1a,BL21(DE3)-pEASY-E1-2a,BL21(DE3)-pEASY-E1-2m,BL21(DE3)-pEASY-E1-1s五种表达系统。在此基础上对醇脱氢酶进行了表达和纯化研究,同时对其底物范围进行了初步检测。结果表明:除1s和2m以包涵体状态存在外,其他三种醇脱氢酶均可以进行可溶性表达。其中3s在pBAD表达载体中的表达条件为:25℃经0.05mg/mL L-ara(L-阿拉伯糖)诱导表达过夜。该酶经离子交换层析纯化后,1L菌液可获得蛋白150mg,纯度约为60%。其ORF为744bp,编码247个氨基酸,分子量26kDa。该酶对乙酰乙酸乙酯和A7的前体5R-6-氰基-3-氧代己酸叔丁酯(A6)等β-酮类底物活性较好,其中对乙酰乙酸乙酯的活性可以达到16.4U/mg。1a的表达条件为:37℃,180rpm摇菌至OD600为0.4时,16℃静置90min至OD600为0.6-0.8,加入IPTG至浓度为0.1mM,16℃诱导表达5小时。2a的表达条件同1a相似,只是诱导温度为25℃,诱导时间为12小时。两者经Ni2+亲和层析后,1a 1L菌液中可以获得蛋白15mg,2a可以获得蛋白13.8mg,纯度都在95%以上。1a的ORF为1071bp,编码356个氨基酸,分子量42kDa;2a的ORF为1074bp,编码357个氨基酸,分子量为42kDa,它们对β-酮类底物活性较差,推测其对含有大侧链的底物活性较好。1s的ORF为795bp,编码264个氨基酸,分子量30kDa。2m的ORF为1029bp,编码342个氨基酸,分子量为38kDa。1s和2m在表达载体pESAY-E1中经IPTG诱导表达后均以以包涵体状态存在,须经变复性后再进行进一步研究。