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目的:观察电针“曲池”“血海”“足三里”穴对荨麻疹大鼠体内肥大细胞脱颗粒过程中FcεRI级联反应限速蛋白(Lyn、Syk)及其下游MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达水平的影响,探讨电针干预荨麻疹的潜在生物学机制,为临床应用针灸治疗荨麻疹提供实验依据。材料与方法:1材料SPF级健康雄性SD大鼠37只,体质量180～220 g,来源于辽宁长生生物技术股份有限公司,许可证号:SCXK(辽)2015-0001。所有大鼠于恒温25℃、湿度50%、明暗周期为12 h的条件下自由饮水、摄食,适应性饲养1周后开展实验。随机选取5只大鼠用于抗卵蛋白血清制备,剩余32只SD大鼠按照随机数字表法随机分为空白组、模型组、电针组、阳性药物组,每组各8只,分别用于动物造模及相应干预治疗。本次动物实验符合辽宁中医药大学实验动物伦理委员会标准。2方法2.1动物造模方法抗卵白蛋白血清制备:取SD大鼠5只,将0.25 mg/支皮内注射用卡介苗活菌(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)溶于0.5 m L/支的灭菌注射用水中,制备成卡介苗稀释剂。每只鼠腹腔注射1 m L卡介苗稀释剂,同时取1%卵白蛋白生理盐水溶液注入于两后肢肌内,每侧各0.5 m L,隔日1次,共致敏3次,末次致敏10 d后,采取腹主动脉血液,分离血清并混合,-80℃保存备用。采用皮肤被动过敏反应方法复制荨麻疹大鼠模型。以水合氯醛浅麻醉大鼠后,在其背中线两侧距脊柱1.5 cm范围内剪毛,用红笔在背部皮肤拟注射血清的部位做好标记。于模型组、电针组、阳性药物组大鼠脊柱两侧标记点处皮内对称注射1∶10稀释的抗卵白蛋白血清0.1 m L/点,使其形成圆形规则皮丘,空白组仅给予注射等量0.9%氯化钠溶液。48 h后,4组大鼠均给予尾静脉注入含1 mg/m L卵白蛋白和0.5%伊文斯蓝的0.9%氯化钠溶液(1 m L/100 g)进行抗原攻击。完成尾静脉注射30 min后即可取材。2.1.3干预方法抗原攻击前7天,电针组参照《实验针灸学》中穴位定位,取双侧“足三里”“曲池”“血海”穴进行电针治疗,0.20 mm×25 mm毫针垂直进针5 mm后连接电针仪,选用疏密波型,频率2 Hz/15 Hz,电流强度1 m A,留针20 min/次,1次/d,连续7 d。阳性药物组大鼠以氯雷他定成人用量10 mg/d为标准,根据人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值换算用药量,予氯雷他定1 mg×kg-1×d-1灌胃,连续7 d。空白组、模型组不予干预,仅给予相应的抓取与固定。相应造模操作均在当日干预治疗结束1 h后进行。2.2检测指标及方法2.2.1皮肤组织病理形态及血清生化指标检测及方法:(1)直尺测量皮肤蓝斑直径;(2)比色法检测皮肤组织伊文斯蓝染料渗出量;(3)HE染色法观察皮肤组织病理改变;(4)ELISA法检测血清Ig E、组胺水平。2.2.2皮下疏松结缔组织肥大细胞相关检测指标及方法:(1)甲苯胺蓝染色法观察皮下疏松结缔组织中肥大细胞脱颗粒情况;(2)免疫组化法检测皮下疏松结缔组织肥大细胞脱颗粒过程中Lyn、Syk蛋白表达水平。2.2.3皮肤组织肥大细胞相关检测指标及方法:(1)甲苯胺蓝染色法观察皮肤组织肥大细胞脱颗粒情况;(2)免疫组化法检测皮肤组织TNF-a、IL-6阳性表达水平;(3)Western blot法检测皮肤组织MAPK信号通路蛋白表达水平;(4)Western blot法检测皮肤组织NF-κB信号通路相关蛋白表达水平。2.2.4腹腔肥大细胞相关检测指标及方法:(1)甲苯胺蓝染色法观察腹腔肥大细胞脱颗粒情况;(2)ELISA法检测腹腔肥大细胞释放TNF-α、IL-6含量;(3)Western blot法检测腹腔肥大细胞MAPK信号通路相关蛋白表达水平;(4)Western blot法检测腹腔肥大细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达水平。2.3统计方法各检查指标结果以均数±标准差(±s)表示,采用SPSS 18.0统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析评价整体差异性,若各组数据服从正态分布,且方差齐,采用LSD法,若数据非正态分布或方差不齐时采用Dunnett’s T3法分析,P<0.05为差异有统计学意义的标准。结果:1皮肤组织病理形态及血清生化指标检测结果1.1各组大鼠皮肤蓝斑直径比较空白组大鼠致敏部位皮肤未出现蓝斑,模型组皮肤出现明显蓝斑,差异有统计学意义(P<0.01),说明造模成功。与模型组比较,电针组、阳性药物组蓝斑直径均明显减小(P<0.01),阳性药物组蓝斑直径略小于电针组,但差异无统计学意义(P>0.05)。1.2各组大鼠皮肤组织伊文斯蓝染料渗出量比较各组大鼠致敏部位皮肤出现以抗血清注射点为中心的蓝染区域,其中,空白组致敏部位皮肤蓝色染料渗出量较少,与空白组比较,模型组皮肤染料渗出量明显增加(P<0.01);与模型组比较,电针组、阳性药物组染料渗出量均明显降低(P<0.01),与电针组相比,阳性药物组染料渗出量略降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。1.3各组大鼠皮肤组织形态学比较空白组皮肤组织表皮层细胞排列层次清晰,真皮层未见明显炎性细胞浸润;模型组大鼠表皮层增厚,细胞排列层次紊乱,细胞间水肿明显,真皮层内大量炎性细胞浸润;阳性药物组、电针组表皮层薄,细胞排列层次清晰,水肿及炎性浸润较模型组明显改善。1.4各组大鼠血清Ig E、组胺含量变化与空白组比较,模型组血清总Ig E、组胺水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,电针组、阳性药物组血清总Ig E、组胺水平均明显降低(P<0.05,P<0.01);与电针组比较,阳性药物组血清总Ig E水平明显降低(P<0.05),组胺水平有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。2皮下疏松结缔组织肥大细胞相关指标检测结果2.1各组大鼠皮下疏松结缔组织肥大细胞脱颗粒比较空白组大鼠皮下结缔组织中肥大细胞多呈稳定状态,细胞脱颗粒率较低;与空白组比较,模型组致敏部位皮下疏松结缔组织中肥大细胞脱颗粒率明显增加(P<0.01);与模型组相比,电针组及阳性药物组肥大细胞脱颗粒率明显降低(P<0.01);与电针组相比,阳性药物组肥大细胞脱颗粒率明显降低(P<0.01)。2.2各组大鼠皮下疏松结缔组织肥大细胞p-Lyn、Lyn蛋白表达比较与空白组比较,模型组致敏部位皮下疏松结缔组织中肥大细胞p-Lyn与Lyn阳性表达水平显著增高(P<0.01);与模型组比较,电针组和阳性药物组p-Lyn与Lyn阳性表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01);与电针组相比,阳性药物组p-Lyn与Lyn阳性表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。2.3各组大鼠皮下疏松结缔组织肥大细胞p-Syk、Syk蛋白表达比较与空白组比较,模型组致敏部位皮下疏松结缔组织中肥大细胞p-Syk与Syk阳性表达水平显著增高(P<0.01);与模型组比较,电针组和阳性药物组p-Syk与Syk阳性表达水平显著降低(P<0.01);与电针组相比,阳性药物组p-Syk阳性表达水平显著降低(P<0.01),Syk阳性表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。3皮肤组织肥大细胞相关指标检测结果3.1各组大鼠皮肤组织肥大细胞脱颗粒比较空白组大鼠致敏部位皮肤组织中肥大细胞多呈稳定状态,细胞脱颗粒率较低;与空白组比较,模型组皮肤组织肥大细胞脱颗粒率明显增加(P<0.01);与模型组相比,电针组及阳性药物组肥大细胞脱颗粒率明显降低(P<0.01);与电针组相比,阳性药物组肥大细胞脱颗粒率差异无统计学意义(P>0.05)。3.2各组大鼠皮肤组织中肥大细胞TNF-α、IL-6表达水平比较与空白组相比,模型组致敏部位皮肤组织中肥大细胞TNF-α、IL-6阳性表达水平显著增高(P<0.01);与模型组相比,电针组、阳性药物组肥大细胞TNF-α、IL-6阳性表达水平显著降低(P<0.01);与电针组相比,阳性药物组肥大细胞TNF-α、IL-6阳性表达显著降低(P<0.01)。3.3各组大鼠皮肤组织肥大细胞MAPK信号通路相关蛋白表达比较与空白组比较,模型组p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-P38MAPK/P38MAPK比值显著增加(P<0.01);与模型组比较,电针组、阳性药物组p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-P38MAPK/P38MAPK比值显著降低(P<0.05,P<0.01);与电针组比较,阳性药物组p-ERK/ERK、p-JNK/JNK比值显著降低(P<0.01),p-P38MAPK/P38MAPK比值差异无统计学意义(P>0.05)。3.4各组大鼠皮肤组织肥大细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达比较与空白组比较,模型组致敏部位皮肤组织NF-κBp65蛋白表达明显增加(P<0.05),IκBα蛋白表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,电针组、阳性药物组皮肤组织NF-κBp65蛋白表达明显降低(P<0.05),IκBα蛋白表达明显增加(P<0.01);与电针组比较,阳性药物组NF-κBp65、IκBα蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。4腹腔肥大细胞相关指标检测结果4.1各组大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒比较空白组腹腔肥大细胞胞膜光滑完整,细胞核清晰;模型组胞膜破裂不完整,细胞周围散在数量不等的异染性颗粒;电针组与阳性药物组肥大细胞形态多规则,胞膜完整,胞质呈均一染色。与空白组比较,模型组腹腔肥大细胞脱颗粒率明显增高(P<0.01);与模型组比较,电针组、阳性药物组脱颗粒率明显降低(P<0.01);阳性药物组脱颗粒率低于电针组,但差异无统计学意义(P>0.05)。4.2各组大鼠腹腔肥大细胞释放TNF-α、IL-6含量比较与空白组比较,模型组腹腔肥大细胞释放TNF-α、IL-6含量均增加(P<0.01);与模型组比较,电针组、阳性药物组腹腔肥大细胞释放TNF-α、IL-6含量均降低(P<0.05,P<0.01),阳性药物组TNF-a、IL-6含量低于电针组,但差异无统计学意义(P>0.05)。4.3各组大鼠腹腔肥大细胞MAPK信号通路相关蛋白表达比较与空白组比较,模型组腹腔肥大细胞p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-P38MAPK、P38MAPK蛋白表达增加(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,电针组p-ERK、p-JNK、JNK、p-P38MAPK蛋白表达降低(P<0.05),ERK、P38MAPK表达差异无统计学意义(P>0.05);阳性药物组p-ERK、p-JNK、JNK、p-P38MAPK、P38MAPK蛋白表达降低(P<0.05),ERK表达差异无统计学意义(P>0.05)。与电针组比较,阳性药物组除P38MAPK明显降低外(P<0.01),其他指标差异无统计学意义(P>0.05)。3.4各组大鼠腹腔肥大细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达比较与空白组比较,模型组腹腔肥大细胞NF-κBp65蛋白表达显著增加(P<0.01),IκBα蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,电针组、阳性药物组NF-κBp65蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),IκBα蛋白表达显著增加(P<0.01);与电针组比较,阳性药物组NF-κBp65蛋白表达显著降低(P<0.01),IκBα蛋白表达显著增加(P<0.01)。结论:1.电针“曲池”“血海”“足三里”穴可有效降低荨麻疹大鼠血清Ig E、组胺水平,减轻皮肤组织毛细血管扩张,降低血管通透性及血浆外渗量,改善皮肤组织病理形态变化。2.电针“曲池”“血海”“足三里”穴可通过调控肥大细胞脱颗粒过程中FcεRI级联反应限速蛋白Lyn、Syk的激活,降低荨麻疹大鼠皮下疏松结缔组织中肥大细胞脱颗粒率,发挥抗过敏作用。3.电针“曲池”“血海”“足三里”穴可通过抑制荨麻疹大鼠皮肤组织肥大细胞脱颗粒而发挥抗过敏作用,其具体机制可能是通过抑制IκBα蛋白降解,下调NF-κBp65蛋白及MAPK信号通路相关蛋白表达,进而抑制炎症因子TNF-α、IL-6的释放,从而减轻炎性过敏反应程度。4.电针“曲池”“血海”“足三里”穴可通过抑制IκBα蛋白降解,下调NF-κBp65蛋白表达,抑制MAPK信号转导通路的激活,最终抑制荨麻疹大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒并释放炎症因子TNF-α、IL-6,从而发挥抗过敏作用。