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第一部分[目 的]为了筛选胆绿素治疗大鼠脑缺血/再灌注损伤中的miRNs表达谱及差异表达的miRNA。[方 法]在给予胆绿素治疗大鼠脑缺血/再灌注损伤后,首先通过TTC染色检测大脑梗死面积,然后用酶联吸附免疫测定检测血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。另外,分别取Sham(假手术)组、IR(模型)组、IR+BV(胆绿素治疗)组的大鼠缺血侧脑皮质进行miRNA芯片测序,然后根据芯片测序数据绘制热图筛选差异表达的miRNA,对差异表达的miRNA则是采用qPCR进行进一步体内验证。[结 果]胆绿素治疗大鼠脑缺血/再灌注损伤后,大鼠缺血侧的脑梗死面积降低(P<0.05);胆绿素治疗后,血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达减少(P<0.05);胆绿素治疗后,miRNA芯片结果显示miR-27a-3p是10个差异表达miRNAs之一(P<0.05);miR-27a-3p的qPCR体内验证结果表达变化趋势和芯片结果相符合。[结 论]在胆绿素治疗大鼠脑缺血/再灌注损伤后,miR-27a-3p的表达上调,结果揭示了 miR-27a-3p的差异表达可能和胆绿素治疗大鼠脑缺血/再灌注损伤有关。第二部分[目 的]对Small RNA测序中筛选出的rno-miR-27a-3p进行其靶基因预测、生物信息学分析及鉴定,以期为探讨和研究miR-27a-3p在胆绿素治疗大鼠脑缺血再灌注损伤中的生物学作用奠定一定的基础。[方 法]用miRwalk、miRDB、Target Scan等三个数据库分别预测mo-miR-27a-3p的靶基因,然后,取三个数据库的交集靶基因进行基因功能富集分析(Gene Ontology)及信号通路富集分析(KEGG pathway analysis)。另外,通过NCBI数据库分别搜索交集靶基因的描述和报道情况。[结 果]三个数据库的交集靶基因共有42个。在基因功能富集分析中,结果显示:生物过程层面,靶基因主要富集于细胞蛋白修饰、细胞应激、死亡、凋亡等有关的GO条目中(P<0.05);在细胞组分层面,靶基因富集于细胞膜、细胞器、细胞核等有关的GO条目中(P<0.05);在分子功能层面,靶基因主要富集于蛋白激酶活性、膜受体激动、蛋白质结合等有关的GO条目中(P<0.05)。在KEGG信号通路分析中,结果显示:靶基因主要富集于分p53信号通路、Wnt信号通路mTOR信号通路、cGMP-PKG信号通路、自噬调节通路等5条通路中(P<0.05)。而其中,基因Litaf参与到了p53信号通路、自噬通路。[结 论]rno-miR-27a-3p可能靶向调控Litaf基因,因此在胆绿素治疗大鼠脑缺血再灌注损伤中发挥生物活性作用。第三部分[目 的]为明确miR-27a-3p是否能靶向调控基因Litaf。[方 法]首先,通过Target Scan数据库预测miR-27a-3p与Litaf之间的结合位点,然后根据结合位点构建含有Litaf-3’UTR-野生型、Litaf-3’UTR-突变型以及miR-27a-3p mimic的重组质粒载体。然后,重组质粒载体共转染293T细胞,采用双荧光素酶报告基因实验系统来检测荧光素酶的相对活性。[结 果]Target Scan数据库预测结果显示:miR-27a-3p与Litaf之间有潜在的结合位点。另外,重组质粒测序的结果显示:成功将Litaf-3’UTR-野生型、Litaf-3’UTR-突变型以及miR-27a-3p mimic构建到pmirGLO质粒载体中;双荧光素酶报告实验结果显示:Litaf野生型+rno-miR-27a-3p mimics组的酶相对活性(0.64±0.007),相比较于 Litaf 野生型+mimics NC(1.00±0.0)低(P<0.001)。[结 论]miR-27a-3p与基因Litaf有一定的结合作用。第四部分[背景]脑缺血/再灌注损伤常伴随异常的免疫炎症反应,而miR-27a-3p作为胆绿素治疗脑缺血/再灌注损伤后差异表达的miRNA之一,其作用仍然不清楚。通过生物信息学预测和双荧光素酶报告实验的验证,结果显示miR-27a-3p可以靶向调控基因Litaf,然而,miR-27a-3p调控Litaf在大鼠脑缺血/再灌注损伤中的作用仍需要进一步的研究。[目的]探讨和研究miR-27a-3p调控Litaf在大鼠脑缺血/再灌注损伤中潜在的作用及作用机制。[方 法]首先,通过侧脑室立体定向注射miR-27a-3p mimic/inhibitor、Litaf以建立基因过表达和干扰模型。然后,在此基础上,建立MCAO模型。我们通过qPCR检测IR中miR-27a-3p/Litaf表达变化;然后,采用免疫荧光双染定位基因Litaf的表达,同时采用免疫荧光双染检测miR-27a-3p过表达、干扰后,Litaf在神经元与小胶质细胞中的表达变化;此外,miR-27a-3p过表达或干扰后,通过蛋白免疫印迹检测Litaf、Bax、Bc12、caspase3、以及TLR4/NF-ΚB/IL-6信号通路蛋白表达水平;同时,采用免疫荧光双染的方法,检测miR-27a-3p调控Litaf后,Litaf和TLR4/NF-ΚB/IL-6通路蛋白表达变化。最后,通过TUNEL染色、NISSIL染色、TTC染色、脑组含水量测定、mNSS评分等方法手段评价miR-27a-3p调控Litaf对大脑缺血再灌注损伤的影响。[结 果]①在脑缺血/再灌注中,miR-27a-3p的表达随着再灌注时间的延长而逐渐降低,在IR-24h达到最低点(P<0.01),而Litaf则是逐渐升高(P<0.05),结果显示:miR-27a-p 与 Litaf 的表达呈负相关(R squared=0.8516,P<0.001);②在侧脑室注射注射病毒7天后,通过qPCR检测miR-27a-p/Litaf表达,结果显示:miR-27a-3p过表达组miR-27a-3p的表达量明显增加(P<0.01),抑制表达组miR-27a-3p的表达量降低(P<0.05),结果揭示了基因过表达和干扰模型建立成功;③在IR-24h后,免疫荧光双染定位到Litaf(红色)/Neuron(绿色)、Litaf(红色)/Microglia(绿色)有双染(组合为黄色)。另外,通过计数双染细胞数,可知缺血再灌注后,Litaf在神经元和小胶质细胞中的荧光强度增加(P<0.05);④蛋白免疫印迹结果显示:miR-27a-3p调控Litaf后,Litaf、TLR4/NF-κB/IL-6蛋白表达量降低(P<0.05)、凋亡相关蛋白Bax/caspase3/表达减少(P<0.05),而Bcl2则表达增加(P<0.05),然而,miR-27a-3p的作用可被 Litaf 过表达逆转;⑤miR-27a-3p 调控 Litaf 后,Litaf、TLR4/NF-κB/IL-6 荧光强度减弱(P<0.05);⑥miR-27a-3p调控Litaf后,可减轻IR中大鼠脑皮质细胞凋亡(P<0.05)、中尼氏小体的溶解(P<0.01)、缺血侧的脑梗死面积百分比(P<0.05)及改善IR中大鼠神经功能缺损症状(P<0.05)。[结 论]①在IR-24h后,Litaf在神经元与和小胶质细胞中表达增加;②miR-27a-3p调控Litaf在大鼠脑缺血再灌注损伤中具有抗细胞凋亡、抗损伤的作用;③miR-27a-3p调控Litaf可抑制TLR4/NF-κB/IL-6信号轴通路。