研究背景及意义侵袭和转移是恶性肿瘤导致患者死亡的主要原因,也是恶性肿瘤治疗领域中一直尚未解决的难题,因此,研究恶性肿瘤侵袭转移的分子机制及其相应的治疗策略具有极其重要的意义。恶性肿瘤发生侵袭转移的确切机制目前尚不完全明确,但已知是由一系列具有内在联系的多个步骤组成的、肿瘤细胞与宿主细胞和周围微环境之间相互作用的、连续的、多阶段的、极其复杂的动态过程,涉及肿瘤细胞之间黏附力的降低、肿瘤细胞与基底膜的紧密附着、细胞外基质的降解、肿瘤细胞侵入血管或淋巴管、黏附于内皮细胞而停留在远隔部位、向外侵袭并诱导血管生成、逃避宿主抗肿瘤反应并在转移部位继续生长。从理论上讲,阻断上述多阶段连续过程中的任何一个环节就有可能阻断恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。随着研究的不断深入,人们逐渐认识到肿瘤的生长、侵袭和转移都需要大量新生血管的形成,肿瘤血管生成是指肿瘤细胞诱导的微血管生长及肿瘤微环境中血液循环的建立,在恶性肿瘤的生长、侵袭和转移等过程中发挥了极其重要的作用,并由此提出了抑制肿瘤生长的新途径—抗肿瘤血管生成治疗,已成为现代肿瘤治疗领域的一个重要策略。肿瘤血管生成是一个极其复杂和协调的过程,受多因子不同层次的调控。抗血管生成治疗,以肿瘤的新生血管为作用靶点,通过切断肿瘤的营养供应和转移路径,阻止肿瘤的生长、侵袭和转移,是一种重要的靶向治疗方法。目前研究的诸多血管生成调节因子多为一些下游分子,其单一因子的作用较弱,一种调节因子被阻断后,肿瘤细胞可以通过其它因子及信号途径来调节血管生成,因此,有待于进一步研究发现能调控多种肿瘤血管生成相关因子的关键分子。MTA1基因是近年来新发现的一个与人类多种恶性肿瘤侵袭转移密切相关的基因,其编码的产物MTA1蛋白是一种在进化过程中高度保守的蛋白质,位于细胞核内,是构成核小体重组和脱乙酰基酶复合物的亚单位,在恶性肿瘤细胞的生长、侵袭及转移等信号转导通路中发挥重要的调控作用,已成为恶性肿瘤研究领域的一个热点分子。近年来,MTA1蛋白在恶性肿瘤血管生成过程中的作用越来越引起学者们的重视,已有的研究表明,MTA1蛋白与膀胱癌、胃癌、乳腺癌及前列腺癌等多种恶性肿瘤血管生成密切相关,并能通过调控HIF-1α、VEGF-A等下游分子来促进肿瘤血管生成,提示MTA1蛋白可能是一个潜在的调控恶性肿瘤血管生成的关键分子。非小细胞肺癌和食管癌的发生、发展、侵袭和转移均依赖于血管生成,然而,有关MTA1蛋白与非小细胞肺癌、食管癌血管生成的相关性,目前国内外尚未见相关的研究报道。本研究将针对MTA1蛋白,进行以下3部分的研究：①检测MTA1蛋白在Ⅰ期非小细胞肺癌组织中的表达水平,探讨MTA1蛋白表达与患者临床病理指标、肿瘤血管生成及预后的相关性；②采用RNA干扰技术特异性抑制非小细胞肺癌细胞内MTA1蛋白的表达,探讨MTA1蛋白表达与非小细胞肺癌细胞体外迁移、侵袭及促血管形成能力的相关性；③检测MTA1蛋白在食管癌组织中的表达水平,探讨MTA1蛋白表达与患者临床病理指标、肿瘤血管生成及预后的相关性。第一部分MTA1蛋白表达与Ⅰ期非小细胞肺癌血管生成及预后的相关性研究目的：检测MTA1蛋白在Ⅰ期非小细胞肺癌组织中的表达水平,探讨MTA1蛋白表达与患者临床病理指标、肿瘤血管生成及预后的相关性。方法：收集在山东大学齐鲁医院胸外科行肺癌切除加系统性淋巴结清扫的102例Ⅰ期非小细胞肺癌患者的组织标本,采用免疫组化方法检测MTA1蛋白的表达,抗CD34抗体标记肿瘤组织内的微血管内皮细胞,并计数MVD。应用SPSS13.0软件建立数据库并进行统计分析。χ2检验分析MTA1蛋白、MVD与患者临床病理指标之间的关系,Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,Log-rank检验比较患者的生存差别,Cox回归多因素分析判定独立的预后因素。结果：MTA1蛋白的高表达率为40.2%,与患者临床病理指标无显著相关性(P>0.05),高MVD的表达率为45.1%,与肿瘤组织学类型显著相关(P=0.034)。χ2检验分析显示MTA1蛋白高表达与高MVD显著相关(P=0.008)。MTA1蛋白高表达和高MVD的患者其术后复发/转移率均分别显著高于MTA1蛋白低表达(P=0.004)和低MVD的患者(P=0.007)。单因素生存分析结果显示,MTA1蛋白高表达和高MVD的患者,其术后5年的无病生存率(P=0.001,0.004),总生存率(P=0.005,0.043)和疾病特异性生存率(P=0.006,0.031)均分别显著低于MTA1蛋白低表达和低MVD的患者。Cox回归多因素分析的结果显示,高MVD是判定患者无病生存率的独立预后因素(P=0.044),MTA1蛋白高表达分别是判定患者无病生存率(P=0.011),总生存率(P=0.024)及疾病特异性生存率(P=0.046)的独立预后因素。结论：MTA1蛋白在I期非小细胞肺癌组织中存在高表达,并与肿瘤血管生成和患者不良预后密切相关；检测MTA1蛋白的表达水平可作为预测肿瘤血管生成和判定患者不良预后的参考指标。第二部分MTA1蛋白表达与非小细胞肺癌细胞体外迁移、侵袭及促血管形成能力的相关性研究目的：采用RNA干扰技术特异性抑制非小细胞肺癌细胞内MTA1蛋白的表达,探讨MTA1蛋白表达与非小细胞肺癌细胞体外迁移、侵袭及促血管形成能力的相关性。方法：采用实时荧光定量PCR和western blot检测非小细胞肺癌细胞株A549、H292、H460和95-D中MTA1mRNA和蛋白的表达水平,以脂质体2000作为转染试剂,将特异性沉默MTA1基因的siRNA转染入MTA1基因表达水平最高的细胞株内,荧光标记的阴性对照序列检测转染效率,实时荧光定量PCR和western blot检测干扰效果。细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化；Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化；明胶酶谱检测细胞培养上清液中MMP-9活性的变化；体外内皮细胞成管实验检测细胞促血管形成能力的变化。结果：MTA1mRNA和蛋白在4种非小细胞肺癌细胞株中均存在不同程度的表达,其中95-D细胞的表达水平最高,MTA1siRNA转染48小时后,实时荧光定量PCR和western blot检测结果发现95-D细胞中MTA1基因的表达在mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.01)水平均被显著抑制。95-D细胞内MTA1蛋白的表达被抑制后,划痕实验结果显示细胞的迁移能力显著降低(P<0.01)；Transwell侵袭实验结果显示细胞的侵袭能力显著降低(P<0.01)；明胶酶谱实验结果显示细胞培养上清液中MMP-9的活性显著降低(P<0.01)；体外内皮细胞成管实验结果显示细胞的促血管形成能力显著降低(P<0.01)。结论：在体外,抑制95-D细胞中MTA1蛋白的表达后,细胞的迁移、侵袭及促血管形成能力均显著降低,表明MTA1蛋白在95-D细胞体外迁移、侵袭及促血管形成过程中发挥重要的调控作用,MTA1蛋白可能成为抗非小细胞肺癌侵袭转移及血管生成治疗的新靶点。第三部分MTA1蛋白表达与食管癌血管生成及预后的相关性研究目的：检测MTA1蛋白在食管癌组织中的表达水平,探讨MTA1蛋白表达与患者临床病理指标、肿瘤血管生成及预后的相关性。方法：收集在山东大学齐鲁医院胸外科行食管癌切除加系统性淋巴结清扫的131例食管鳞癌患者的组织标本,采用免疫组化方法检测MTA1蛋白的表达,抗CD34抗体标记肿瘤组织内的微血管内皮细胞,并计数MVD。应用SPSS13.0软件建立数据库并进行统计分析。χ2检验分析MTA1蛋白与患者临床病理指标之间的关系；Nonparametric test分析MVD与患者临床病理指标及MTA1蛋白之间的关系；Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,Log-rank检验比较患者的生存差别,Cox回归多因素分析判定独立的预后因素。结果：MTA1蛋白的高表达率为42.7%,与肿瘤浸润深度(P=0.041)、淋巴结转移(P=0.021)及病理分期(P=0.003)显著相关。MVD的计数范围为3.8-93.4/高倍镜视野,MVD与肿瘤分化程度(P=0.032)及浸润深度(P=0.018)显著相关。Mann-WhitneyU检验分析显示MTA1蛋白高表达与MVD显著相关(P=0.044)。MTA1蛋白高表达的患者其术后复发/转移率显著高于MTA1蛋白低表达的患者(P=0.031)。总的术后5年生存率为37.4%,单因素生存分析结果显示,MTA1蛋白高表达的患者,其术后5年的总生存率显著低于MTA1蛋白低表达的患者(P=0.002)。Cox回归多因素分析的结果显示,病理分期是判定患者总生存率的独立预后因素(P=0.040)。在病理分期的基础上进一步分层生存分析的结果显示,在II期的患者中,MTA1蛋白高表达者的术后5年总生存率显著低于MTA1蛋白低表达者(P=0.006)。结论：MTA1蛋白在食管鳞癌组织中存在高表达,并与肿瘤进展、血管生成和患者不良预后密切相关；检测MTA1蛋白的表达水平可作为预测肿瘤进展、血管生成和判定患者不良预后的参考指标。