论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种对全球生猪产业具有重要经济影响的病原。我国高致病性PRRSV(HP-PRRSV)的出现和流行给养猪生产造成了不可估量的经济损失。与经典PRRSV毒株相比,HP-PRRSV具有更强的复制能力和致死性毒力,可导致以高热、高发病率和高死亡率为特征的严重型猪繁殖与呼吸综合征(AtypicalPRRS)。迄今为止,有关HP-PRRSV复制与致病性相关的分子机制并未完全阐明。本研究聚焦于分析与HP-PRRSV复制和毒力相关的nsp9和nsp10氨基酸位点,同时探讨病毒复制与超感染抵抗之间的关系,以期为阐明HP-PRRSV的复制与致病相关的机制提供科学依据。已有的研究表明HP-PRRSV的nsp9和nsp10赋予其致死性毒力。本研究以PRRSV高、低致病性毒株nsp9和nsp10编码区相互置换的嵌合病毒(RvJHn9n10和RvHJn9n10)及其亲本病毒(RvJXwn和RvHB-1/3.9),经滴鼻攻毒方式感染42日龄健康仔猪,分析了感染猪组织中的病毒分布与载量。结果表明,与RvJXwn相比,在感染后第7d和第14d,RvJHn9n10感染猪肺脏肉眼病变和显微病变较轻;肺脏和腹股沟淋巴结中的病毒滴度也较低;肺脏、胸腺、扁桃体、脾脏、腹股沟淋巴结、下颌淋巴结、肠系膜淋巴结和肺门淋巴结中ORF7基因拷贝数和PRRSV抗原明显减少;在肝脏、胃等组织中ORF7基因的检出率也较低。与此相反,与RvHB-1/3.9相比,在感染后第7 d和第14 d,RvHJn9n10感染猪呈现出较严重的肺脏肉眼病变和显微病变;肺脏和腹股沟淋巴结中的病毒滴度也较高;肺脏、胸腺、扁桃体、脾脏、腹股沟淋巴结、下颌淋巴结、肠系膜淋巴结和肺门淋巴结中ORF7基因拷贝数和PRRSV抗原分布明显升高;在肝脏、胃等组织中ORF7基因的检出率也较高。以上结果表明,nsp9和nsp10的置换可影响病毒在感染猪组织中的病毒载量和肺脏病理损伤程度,补充了 HP-PRRSVnsp9和nsp10与病毒在猪体内的复制能力与致病性相关的实验数据。鉴定了 HP-PRRSV nsp9和nsp10上影响其复制能力和致病性的关键氨基酸位点。利用感染性克隆技术,首先以pWSK-JHn9n10和pWSK-HJn9n10为骨架,构建并拯救nsp9和nsp10差异氨基酸位点的突变病毒,分析突变病毒在肺泡巨噬细胞(PAMs)上的增殖能力。结果表明,nsp9的第586位和592位氨基酸显著影响病毒的复制。进一步利用RvJXwn和RvJHn10的感染性克隆,构建并拯救了一系列突变病毒,分析突变病毒在PAMs上的增殖能力。结果发现,将nsp9的586位苏氨酸突变为丙氨酸,或者将nsp9的592位丝氨酸突变成苏氨酸,或者二者同时突变,突变病毒的病毒滴度和RNA合成效率降低;而当突变427位和609位氨基酸时,突变病毒的病毒滴度和RNA合成效率无明显变化。分析了以RvJXwn、RvJHn10和RvHJn10为骨架的突变病毒对仔猪的致病性。结果显示,突变RvJXwn和RvJHn10 nsp9的586位氨基酸(苏氨酸突变成丙氨酸),或者nsp9的592位氨基酸(丝氨酸突变成苏氨酸),或者二者同时突变,突变病毒感染猪的临床症状和肺脏病理损伤明显减轻,血清中病毒载量和肺脏中病毒抗原降低,其致死性毒力下降;而突变427位和609位氨基酸的突变病毒感染猪的临床症状、肺脏病理损伤、血清中病毒载量和肺脏中病毒抗原以及病死率无显著变化。此外,突变RvHJn10 nsp9的586位氨基酸(丙氨酸突变成苏氨酸)和592位氨基酸(苏氨酸突变成丝氨酸)的突变病毒感染猪的临床症状、肺脏病理损伤、血清中病毒载量和肺脏中病毒抗原以及病死率无明显变化。以上结果表明,HP-PRRSV nsp9的第586和592位氨基酸是影响其在PAMs上的复制能力和致死性毒力的关键位点。分析了 PRRSV的复制与超感染抵抗现象。利用感染性克隆技术,分别构建并拯救RvJXwn、RvHB-1/3.9和RvCHsx1401的nsp2编码区插入3×Myc标签的病毒。拯救病毒(RvMyc-JXwn、RvMyc-HB-1/3.9和RvMyc-CHsx1401)在PAMs上的增殖动态表明,该标签的插入不影响其复制。将 RvJXwn、RvHB-1/3.9 和 RvCHsx1401(MOI=10)分别感染体外培养 36h～48h的PAMs,感染后2 h再接种标签病毒,用免疫荧光抗体技术检测结果发现,已感染PRRSV的PAMs能够抵抗相应同源毒株RvMyc-JXwn、RvMyc-HB-1/3.9和RvMyc-CHsx1401的感染。以紫外线照射和CHX处理感染细胞使病毒灭活,可解除PRRSV的超感染抵抗。经病毒吸附和进入试验以及检测后感染病毒12 h内vRNA和cRNA的合成情况,证实PRRSV超感染抵抗发生在病毒的RNA合成阶段,而非病毒的吸附和进入阶段。此外,分析了 PRRSV异源毒株间的超感染抵抗现象。结果发现,RvJXwn感染PAMs细胞能够抵抗RvMyc-HB-1/3.9和RvMyc-CHsx1401的感染,RvHB-1/3.9 感染 PAMs 细胞能够抵抗 RvMyc-JXwn 和 RvMyc-CHsx1401 的感染,而 RvCHsx1401感染PAMs细胞不能抵抗RvMyc-JXwn和RvMyc-HB-1/3.9的感染。由此提示PRRSV异源毒株间的超感染抵抗可能具有毒株特异性。进一步以RvCHsx1401为骨架,构建置换RvJXwn不同编码区的嵌合病毒(SJ1a、SJ1b和SJSP),并作为先感染的病毒,发现SJ1a和SJ1b能够抵抗RvMyc-JXwn的超感染,提示ORF1a和ORF1b是影响PRRSV超感染抵抗的关键区域。上述结果提示,超感染抵抗在PRRSV减毒活疫苗(MLV)的保护机制中起着重要作用。综上所述,我们的研究:(1)补充了 HP-PRRSVnsp9和nsp10与病毒在猪体内的复制能力与致病性相关的实验数据;(2)解析了 HP-PRRSV nsp9的第586和592位氨基酸是影响其在PAMs上的复制能力和致死性毒力的关键位点;(3)揭示了 PRRSV复制在同源毒株间超感染抵抗建立过程中的作用。研究结果为阐明HP-PRRSV致病的分子机制以及PRRSV减毒活疫苗(MLV)有效性的机制提供了重要的科学依据。