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前言:
肺癌是最常见的肺部原发性恶性肿瘤,世界各国,特别是工业发达的国家,肺癌的发病率和死亡率均迅速上升,目前排名世界癌症死因第一名。肺癌的发病机制和病因亦成为人们研究的热点。转录因子Proxl是一种果蝇prospero同源基因,人类.Proxl基因位于人染色体1q32.2～1q32.3,长度约为58kb,至少含有5个外显子,编码83kD蛋白,在细胞发育分化及机体器官形成过程中起关键性作用,在正常胚胎眼晶体、肝脏、神经元发育过程中Prox1的地位至关重要。
转录因子Prox1是淋巴管生成最基本的调控因子,是淋巴管内皮细胞的特异性标记物,基因剔除Prox1后淋巴管生成受阻。血管内皮异位表达prox1可诱导淋巴特异基因表达。此前有研究显示在肠道肿瘤中转录因子Prox1表达与肿瘤分化程度有关。Prox1表达高的肿瘤预后更加不良,体外RNA干扰特异性敲除Proxl基因使细胞增殖明显减少,而过表达Prox1则可明显的促进肿瘤增殖。
本实验通过检测Prox1在肺癌细胞系中的表达情况,分析Prox1在肺癌侵袭转移过程中所发挥的作用。通过转染正义和反义Prox1,检测肺癌侵袭和迁移活动能力的变化。结果显示:Prox1在非小细胞肺癌的细胞核和细胞浆共表达,而在小细胞肺癌细胞中主要在核表达,并呈强阳性。Prox1表达增加时能促进肺癌侵袭迁移,表达减少时侵袭迁移作用受到抑制,并且Prox1表达变化时Rho蛋白表达水平也随之变化,Prox1表达和RhoA,RhoC表达呈正相关,和RhoB表达呈负相关,由于Rho蛋白在调节细胞骨架,粘附和侵袭迁移运动中起到一定作用,因此我们推测,转录因子Prox1促进肺癌的迁移和侵袭有可能是通过Rho蛋白发挥作用的,并且Prox1参与调节RhoB,RhoC的转录活性。与此同时,Prox1还有可能促进肺癌细胞的增殖能力,其相关机制仍需深入讨论。
材料与方法:
1、主要材料与试剂:
细胞系:人肺腺癌细胞系A549,人小细胞肺癌细胞系H446
主要抗体:Prox1antibody:英国ABCAM公司rabbitpolyclonal;RhoA,RhoB,RhoCantibodies:美国PROTEINTECH公司rabbitpolyclonal;CyclinA,CyclinB1,CyclinD1antibodies:美国CellSignaling
相关试剂:
Trizol试剂购自lnvitrogen公司,RT-PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司,realtime-PCR试剂盒购自TAKARA公司,Transweli小室购自美国ComingCostar公司,Matrigel基质胶购于BD公司,转染试剂:HiPerFectTransfectionReagent和AttracteneTransfectionReagent购自德国QIAGEN公司,CHIPassaykit:Beyotime,Beijing
2、实验方法:
(1)细胞培养
将A549,H446细胞在含有10%胎牛血清的DMEM和1640培养基37℃,5%CO2孵箱孵育,1-2d换新鲜培养液。当细胞长满瓶底后,用0.25%胰酶消化,进行传代。
(2)瞬时转染
细胞培养后按照QIANGENE实验说明步骤进行
(3)westemblot杂交
(4)提取细胞总RNA
(5)RT-PCR:根据北京TRANSGENG试剂盒步骤RT-PCR
(6)realtime-PCR:大连TAKARA公司qPCR试剂盒
(7)Transwell迁移实验
(8)划痕试验
(9)Transwell侵袭实验
(10)细胞集落形成实验
(11)染色质免疫共沉淀:按照Beyotime试剂盒步骤进行,RT-PCR检测结果。
(12)统计分析
结果:
1、Prox1调节肺癌细胞增殖；
2、Prox1表达与肺癌细胞的迁移和侵袭能力相关；
3、Prox1表达与Rho蛋白相关。
结论:
1、转录因子Prox1促进肺癌细胞增殖;
2、Prox1与肺癌细胞的侵袭迁移能力相关,Prox1表达上调促进肺癌细胞的侵袭和迁移,下调Prox1抑制肺癌细胞的侵袭和迁移;
3、Prox1表达与Rho蛋白相关,Prox1表达与RhoA,RhoC正相关,而与RhoB负相关;
4、转录因子Prox1正向调控RhoC转录,负向调控RhoB转录。