放射性肺损伤(Radiation-induced lung injury, RILI)是战时或平时如核武器损伤、核辐射事故、造血干细胞移植预处理以及胸部肿瘤放疗的常见严重并发症，且目前的临床救治措施并不能有效预防或转归放射性肺炎及进一步的纤维化，病死率极高。制约放射性肺损伤治疗的关键问题一个是DNA氧化损伤，一个是含氧中间产物活性氧(reactive oxygen species，ROS)驱动氧化应激、启动肺泡Ⅱ型上皮细胞和血管内皮细胞等靶细胞产生的炎性细胞因子级联反应。对于DNA氧化损伤，电离辐射的生物学研究表明，细胞DNA是电离辐射(IR)最为主要的靶分子，IR可通过直接电离和ROS间接作用致细胞嘌呤和嘧啶碱基氧化、碱基缺失(AP位点)以及单链断裂进而形成双链断裂，人体细胞乃至所有生物细胞都存在着核苷酸切除修复、碱基切除修复、双链断裂修复和错配修复等四个较为完善的DNA修复通路，这是细胞维持基因组稳定和完整的一种基本防御及保护机制。目前的研究表明，脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease1,APE1)又称为氧化还原因子(redox factor-1，Ref-1)，它不仅是DNA碱基切除修复途径的主要限速酶，还是一种能通过调控多种转录因子氧化还原状态，对氧化应激诱导细胞凋亡具有防御作用的保护基因。已有研究提示辐射诱导的核转录因子-κB(NF-κB)可能在调节炎性细胞因子级联反应产生非靶向性效应，从而在介导和放大放射性肺损伤中发挥关键作用，针对抑制NF-κB活性的研究将可能为开发放射性肺损伤特殊的治疗方法提供一个平台。多酚类小分子化合物三羟基异黄酮具有下调辐射所致Ape1/Ref-1表达增加从而抑制NF-κB DNA结合活性功能。但目前关于Ape1/Ref-1蛋白在放射性肺损伤的表达特点、规律及作用机制尚不清楚，也无明确有效的RILI防治措施，严重制约着放射性肺损伤的防治，研究阐明这些问题对提高放射性肺损伤的救治水平有非常重要的意义。研究目的1.研究三羟异黄酮(genistein, GEN)下调Ape1/Ref-1的表达对放射性肺损伤的保护作用及其分子机制，为防治放射性肺损伤提供理论依据。2.研究Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒联合血卟啉衍生物（hematoporphrphyrinderivative, HpD）介导的光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）对人肺腺癌细胞A549的杀伤作用及其分子机制，进一步验证在放射性肺损伤防护中Ape1/Ref-1-NF-κB的作用途径，理论上进一步丰富我们对Ape1/Ref-1分子生物功能的认识。研究内容和方法1. Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒的构建、扩增；2.三羟异黄酮防护放射性肺损伤的效应观察：建立三羟异黄酮及氨磷汀防护放射性肺损伤小鼠模型（与对照组比较）：不同时间给予三羟异黄酮及氨磷汀，检测组织病理形态、肺组织羟脯氨酸含量；应用液相芯片法、双抗体夹心法、ROS特异性荧光探针技术检测血清、肺泡灌洗液中炎性细胞因子（IL-1、TNF-α、IL-6、TGFβ1）/炎性细胞数和胞内ROS含量的改变；以明确三羟异黄酮的防护效应、给药时机、量效和时效关系，为下一步实验做准备；3.三羟异黄酮防护放射性肺损伤靶细胞（肺泡II型上皮细胞和内皮细胞）的机制探讨：应用对照研究，采用Western blot法及EMSA等技术检测三羟异黄酮下调辐射所致Ape1/Ref-1表达增加；三羟基异黄酮下调Ape1/Ref-1表达对NF-κB活性的影响；4.调控Ape1/Ref-1对协同效应的影响及可能机制：应用外源性干预（Ape1/Ref-1RNAi转染）对A549细胞增殖抑制影响；Western blot法及EMSA法分别检测APE1蛋白的表达及NF-κB活性影响来验证下调Ape1/Ref-1与NF-κB的协同效应及可能机制。研究结果1.三羟异黄酮防护放射性肺损伤的效应观察：病理检测显示照射后时间越长，放射性肺损伤小鼠肺纤维化越重，三羟异黄酮能减轻肺组织炎症及纤维化；照射后小鼠血清及肺泡灌洗液中TGF-β1、IL-6、IL-1和TNF-α等炎性因子和肺组织羟脯氨酸的含量也呈递增趋势，三羟异黄酮能降低各种炎性因子和羟脯氨酸的含量(P<0.05)，尤其是照射前24h给予三羟异黄酮能达到与照射前30分钟给予氨磷汀类似的疗效。2.三羟异黄酮防护放射性肺损伤的机制探讨：经射线照射后，A549细胞内ROS含量明显升高，三羟异黄酮能明显降低胞内ROS的表达；三羟异黄酮能下调放疗所致的APE1蛋白及NF-ΚB表达的升高（P<0.05）。3.验证调控Ape1/Ref-1对NF-κB协同效应的影响：HpD-PDT作用后，A549细胞增殖受抑、凋亡增加显著高于对照组（P<0.05），其抑制效率依赖于HPD浓度及激光剂量，同时Ad5/F35-APE1siRNA联合PDT对A549细胞具有更明显的增殖抑制作用，胞内ROS含量及炎性因子的表达显著升高（P<0.05）。HpD-PDT诱导A549细胞APE1蛋白表达增强在24h达到高峰，10MOI Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒感染A549细胞48小时抑制APE1表达最为显著。结论1.放射性肺损伤小鼠模型研究显示，辐射诱导肺组织核蛋白APE1/Ref-1表达显著增高，呈现由胞核向胞浆移位并先增高后降低特征；辐射诱导APE1/Ref-1表达增加和异位表达，可通过其DNA损伤修复和/或氧化还原功能影响放射性肺损伤修复。2. APE1/Ref-1是炎性因子的调控因子，血清/肺泡灌洗液TGF-β1、IL-6、 IL-1β和TNF-α含量是放射性肺损伤的预测指标。研究发现为预测放射性肺损伤的发生提供了生物学预测指标。3.三羟异黄酮调控APE1/Ref-1表达防护放射性肺损伤的重要作用并阐明了其调控机制。三羟异黄酮可显著减轻放射性肺损伤小鼠肺泡腔内炎性渗出以及肺组织羟脯氨酸含量和胶原纤维沉积，其作用机制与其降低APE1/Ref-1及NF-ΚB表达从而减轻炎性因子分泌有关。研究发现为放射性肺损伤的防治提供了新的手段和方法。4.三羟异黄酮对防护放射性肺损伤具有独特优势。对于肺部肿瘤放射治疗，三羟异黄酮在下调Ape1/Ref-1表达防护RILI的同时，尚可通过调控其DNA损伤修复和Redox双功能增加肺癌细胞放射治疗敏感性。5. Ad5/F35-APE1siRNA重组腺病毒能显著增强A549细胞PDT敏感性，主要是通过2种机制实现的：一方面通过抑制A549细胞PDT后的DNA损伤修复能力；另一方面通过抑制A549细胞对PDT所致氧化损伤的修复。6. PDT可诱导肺腺癌A549细胞APE1蛋白表达增强，但通过Ad5/F35-APE1siRNA可抑制PDT诱导的APE1蛋白的表达。