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黄病毒是一大类严重危害人或动物健康的单股正链RNA病毒,该类病毒多通过蚊子等吸血昆虫传播。乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)、登革热病毒(Dengue virus,DENV)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是典型的黄病毒。JEV和WNV引起人的病毒性脑炎;JEV还对猪等养殖业影响巨大;DENV主要造成发热和急性出血;ZIKV导致成人的吉兰-巴雷综合征与胎儿小头畸形。这四类黄病毒危害严重,但缺乏特效治疗药物,亟待广谱性抗黄病毒药物的研发。青蒿素(Artemisinin)是经典的抗疟药,近年来国内外研究表明,青蒿素及其衍生物青蒿琥酯(Artesunate)等对多种病毒的感染具有治疗效果,但青蒿素能否用于黄病毒的抗病毒治疗尚不清楚。本研究以JEV、DENV和ZIKV为例,通过体内外实验研究青蒿素对黄病毒复制的抑制作用及抗病毒机制。具体内容如下:1. 青蒿素抑制JEV、DENV、ZIKV复制体外实验中将被JEV、DENV、ZIKV感染的宿主细胞分为青蒿素处理组和对照组,青蒿素处理组是在换液更新的培养基中添加无毒性浓度的青蒿素,对照组则在培养基中添加等量溶剂DMSO。收取不同时间点的细胞样品和上清样品,通过实时荧光定量PCR检测青蒿素对病毒复制RNA水平的影响,使用空斑实验检测青蒿素对病毒增殖滴度的作用。研究结果显示,宿主细胞被JEV、DENV和ZIKV感染后,青蒿素处理组相较对照组在RNA水平上显著抑制病毒复制。空斑检测的结果也显示青蒿素处理组显著抑制上清中的病毒增殖滴度:在24h样品中,青蒿素处理可减少细胞上清中约100倍的感染性JEV病毒颗粒,抑制DENV、ZIKV的复制约10倍;在36h样品中,青蒿素处理组相较对照组能抑制10倍左右的JEV、DENV、ZIKV病毒滴度。实验结果证明青蒿素对黄病毒中JEV、DENV、ZIKV的复制具有显著的抑制作用,青蒿素具有潜在广谱性抗黄病毒的效果。2. 青蒿素增强黄病毒诱导的宿主细胞I型干扰素的表达进一步从机理上探究青蒿素抑制黄病毒复制的原因:实时荧光定量PCR和ELISA结果表明,青蒿素促进被JEV、DENV和ZIKV感染的宿主细胞中IFN-β的表达与分泌及IFN下游ISGs分子ISG56、Mx A、OAS-1的表达;Western blot实验证明青蒿素促进IFN-I信号通路p-IRF3、P-STAT1、p-STAT2的磷酸化激活表达;使用IFNAR多克隆抗体阻断干扰素通路后,青蒿素不再显著抑制黄病毒的复制,证实青蒿素通过促进宿主IFN-I的表达发挥抗黄病毒的功能。进一步研究表明青蒿素促进IFN-I表达与RIG-I、TLR3表达呈正相关。3. 青蒿素降低JEV感染小鼠的死亡率并缓解脑炎症状利用JEV感染小鼠模型,在活体水平评价青蒿素对JEV感染的治疗作用。将6周龄的C57BL6J雌鼠随机分为六组进行实验:DMEM+DMSO、DMEM+Artemisinin、DMEM+Artesunate、JEV+DMSO、JEV+Artemisinin、JEV+Artesunate,每组15只,在第0天对小鼠腹腔注射10~5PFU JEV P3/只或等体积的DMEM,在第3天和第4天对小鼠尾静注射10 mg/kg药物青蒿素、青蒿琥酯或等体积的DMSO,持续观察23天。在第5天收取每组5只小鼠的组织样品用于后续检测;使用其余10只小鼠的数据绘制体重、行为、存活率曲线,并收集第23天小鼠的组织样品,完成后续的病理和分子检测。结果显示,JEV+DMSO组小鼠出现了典型的神经症状,死亡率为100%;JEV+Artemisinin组小鼠的死亡率为50%;JEV+Artesunate组小鼠的死亡率为40%。青蒿素或青蒿琥酯的使用提升小鼠的存活率,抑制小鼠体重下降,改善小鼠神经症状,显著降低小鼠全身组织脏器和血液中的病毒载量,实验结束后存活的小鼠体内均检测不到病毒。JEV+DMSO组小鼠脑部出现严重的炎症反应,JEV+Artemisinin和JEV+Artesunate组中小鼠神经胶质细胞增生、神经元细胞死亡显著降低,鼠脑炎症反应明显减弱。动物实验证明青蒿素对感染JEV的小鼠具有良好的治疗效果,结合细胞水平的结果,青蒿素对黄病毒的感染具有潜在的治疗价值,有成为广谱性抗黄病毒药物的应用前景。本研究首次证明青蒿素能够抑制黄病毒JEV、DENV、ZIKV的复制,揭示了青蒿素通过促进宿主细胞IFN-I的表达来抑制黄病毒复制的抗病毒新机制。青蒿素是一种商品化的抗疟药,本研究发现了青蒿素新的生物学效应,提示青蒿素可以作为一种广谱性治疗黄病毒的潜在药物。