研究背景和目的流行病乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE),又称为日本脑炎,简称乙脑。由流行性乙型脑炎病毒感染引起,在世界各地都有报道,尤其是亚洲、西太平洋国家和澳大利亚等。据世界卫生组织统计,在全球24个国家和地区每年约有67900乙脑病例发生。乙脑的病死率为20%-30%,罹患乙脑的幸存患者中约有30%-50%会留有严重神经系统后遗症。我国乙脑发病具有明显的季节性,病例报道主要见于6-10月,乙脑的发病高峰为每年的7-8月,与蚊虫的生长相关。我国乙脑病例主要见于15岁以下的儿童,约占90%,成人较少发病。流行性乙型脑炎病毒,简称乙脑病毒(Japanese encephalitis virus),属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus).乙脑病毒基因组为单股正链RNA,全长约11kb。病毒核酸具有一个开放阅读框(open reading fram,ORF),从5’至3’端依次编码3个结构蛋白(C蛋白、M前体或者M蛋白、E蛋白)和7个非结构蛋白(NSK、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。乙脑病毒通过虫媒进行传播,主要的传播媒介为三带喙库蚊。蚊虫叮咬吸血处于病毒血症期的感染动物而带毒,乙脑病毒在蚊体内经过一个外潜伏期,病毒量增殖,再通过叮咬吸血的方式将病毒传播给易感动物或人。猪是乙脑病毒主要的传染源。一些水鸟,如苍鹭、白鹭等鹭科动物以及蝙蝠可能是乙脑病毒重要的保存宿主。人类感染乙脑病毒后,血液中病毒载量低,而且病毒血症持续的时间较短,无传染性和保存宿主的作用,被认为是乙脑病毒的终末宿主(dead end host).据报道,多种温血动物均可携带乙脑病毒,如牛、羊、蝙蝠、鸟类等。但由于缺乏大规模的流行病学调查资料,这些动物在乙脑病毒传播过程中扮演的角色并不十分明确。鼠类属于哺乳动物纲,啮齿目,鼠科,种属多,数量大,广泛分布于世界。根据鼠类与人类的接触密切程度,又可分为家栖和野栖两类。广东地区常见的家鼠主要有褐家鼠、黄胸鼠和小家鼠三种；野鼠主要是黄毛鼠,又称罗赛鼠、田鼠。鼠是重要的病毒性人兽共患病储存宿主。国内外学者已从鼠形动物体内检测出数十种病毒,例如汉坦病毒、戊肝病毒、正痘病毒、丙肝病毒、森林脑炎病毒、博尔瓦纳病毒、诺如病毒等。目前,尚未有研究报道家鼠或野鼠在乙脑病毒自然史扮演的角色。但已经有研究报道从鼠身上分离出其他黄病毒,如蜱传森林脑炎病、西尼罗河病毒、登革病毒等,提示鼠可能对黄病毒科普遍易感,有潜在感染或携带乙脑病毒的风险。而实验小鼠常被用作为乙脑病毒的感染模型。据报道,实验鼠天生缺乏对黄病毒抵抗的基因,因此,对黄病毒有高度的易感性。颅内接种3日龄的乳鼠常用于乙脑病毒的扩增。而成年实验鼠感染了乙脑病毒后,会出现跟人类乙脑病例相似的症状,如弓背、震颤、强直痉挛、瘫痪等神经系统相关症状。有研究采用腹腔注射乙脑病毒的方式感染实验小鼠后出现病毒血症,说明鼠存在携带或传播乙脑病毒的风险。但目前尚缺乏对家鼠和野鼠是否能携带乙脑病毒的报道。因此,我们赴福建省和广东省采集家鼠和野鼠的样本,检测其是否携带乙脑病毒,并且建立乙脑病毒感染的小鼠模型,检验其携带乙脑病毒的能力。研究方法1、家鼠和野鼠样本的采集2013—2015年在广州市以及厦门市部分公园、医院、农贸市场、学校等地方捕鼠。鼠笼放置的地点主要有建筑墙角、下水道、草丛、垃圾桶旁等。心脏采血处死,无菌开颅,取出部分脑组织。血液样本静置1h后,3 500g/min离心15min,分离出上层血清。采集的标本置于,-80℃冰箱保存,待检。2、家鼠和野鼠脑组织样本乙脑病毒的检测采用Roche High Pure viral RNA kit提取鼠脑组织病毒RNA,用Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录合成cDNA,以逆转录产物cDNA为模板,利用荧光定量RT-PCR法和普通RT-PCR法检测脑组织中的乙脑病毒。3、家鼠和野鼠血清样本乙脑病毒抗体的检测采用间接ELISA检测鼠血清样本乙脑病毒IgG抗体,将阳性样本用病毒中和实验测定中和抗体滴度,然后,用间接ELISA检测鼠血清样本登革病毒IgG抗体,排除登革感染。4、乙脑病毒感染NIH小鼠模型的建立4.1病毒株：本研究使用的2株乙脑病毒株均属于GⅢ型,GD乙脑病毒株于2009年广东地区的大足鼠耳蝠脑组织中分离、鉴定并保存,NAK株(Nakayama株,中山株)乙脑病毒是首次从日本乙脑病人体内分离的乙脑病毒株,由本实验室保存。病毒株通过颅内接种3日龄乳鼠进行病毒扩增,将病毒过滤液感染BHK-21细胞,制成病毒液,并测定TCID50.4.2乙脑病毒株半数致死量测定：分为2个病毒株组(NAK组和GD组),每个组分为6个剂量小组(10～105 TCID50/100μL),每个剂量小组有6只NIH小鼠,雌雄各半,5-6周龄,共用72只小鼠。设立1个对照组,共6只小鼠。将原病毒液稀释成10～105TCID5o/100μL6个浓度梯度。采用腹腔注射的方式,按不同的浓度梯度分组,每只小鼠100gL。对照组给予每只小鼠100μL PBS溶液。注射乙脑病毒后,共观察21天。将发病死亡的小鼠无菌解剖,取脑组织进行乙脑病毒检测。将不发病小鼠在感染病毒后21天眼球取血、处死,检测血清乙脑病毒中和抗体。4.3乙脑病毒感染小鼠：分为2个病毒株组(NAK组和GD组),每个病毒株组有30只小鼠,雌性,5-6周龄,共用60只小鼠。设立1个对照组,共15只小鼠。(1)初次感染：采用腹腔注射的方式,按不同的病毒株组,给予每只小鼠乙脑病毒毒力为103TCID50/100μL.对照组给予每只小鼠100μL PBS溶液。病毒组分别在感染后4、7、8、10、11、12、13、14、17d剖杀1-3只小鼠,对照组在相同的时间剖杀1只小鼠,下颌下取血后处死,并分离出上层血清。无菌解剖后取脑、肝、脾样本。检测小鼠血液、脑、肝、脾乙脑病毒的检测,检测小鼠血清乙脑病毒中和抗体。(2)再次感染：初次感染35d后,将存活的小鼠进行再次感染,NAK组、GD组注射病毒毒力和剂量如前,对照组腹腔注射NAK株乙脑病毒,103TCID50/100μL,100μL。再次感染后,观察小鼠的死亡情况,分别在再次感染后7、14、21d下颌下取约500ul血液。再次感染21d取血后,处死全部小鼠。检测小鼠血清乙脑病毒中和抗体。4、质量控制(1)移液枪头、冻存管、EP管等实验耗材均为一次性用品；(2)RNA的提取和逆转录所用的容器和试剂如移液枪头、EP管等,均事先进行DEPC水处理,防止环境中RNA酶的污染；(3)细胞培养的所有操作均在细胞培养间的超净台内进行,防止污染；(4)鼠的解剖在无菌间生物安全柜进行,全程戴帽子、口罩和手套,做好个人防护工作；(5)实验过程严格设立阴、阳性对照及空白对照；(6)鼠的血清采集和保存应严防细菌污染。研究结果1、家鼠和野鼠样本采集的基本情况本次研究在广州市和厦门市部分地区共采集了198只鼠,包括褐家鼠(Rattus norvegicus)159只,黄毛鼠(Rattus lossea Swinhoe)27只,黄胸鼠(Rattus flavipectus)10只,小家鼠(Mus musculus Linnaeus)2只。共获188份鼠脑组织样本,96份鼠血清样本。2、家鼠和野鼠脑组织样本乙脑病毒的检测采用荧光定量RT-PCR和普通RT-PCR对188份脑组织样本进行乙脑病毒的检测,结果均为阴性。3、家鼠和野鼠血清样本乙脑病毒抗体的检测对采集的96份鼠血清样本进行乙脑病毒IgG抗体检测,结果显示45.8%(44/96)血清样本为阳性。广州市和厦门市鼠乙脑病毒IgG抗体检测率分别为44.1%(15/34),46.0%(29/62)。对上述乙脑病毒IgG抗体阳性的44份血清样本进行乙脑病毒中和抗体滴度测定,由于有8份样本血清量不足,只对36份样本进行了病毒中和试验。试验结果显示,61.5%(24/39)血清样本为乙脑病毒中和抗体阳性(抗体滴度≥1：1O),中和抗体滴度为1：10-56。对上述乙脑病毒IgG抗体阳性的44份血清样本进行登革病毒IgG抗体,ELISA结果显示,这些血清样本均未登革病毒IgG抗体,可排除登革病毒的感染。4、乙脑病毒感染NIH小鼠模型的建立4.1小鼠感染乙脑病毒后的症状：NAK株病毒组中,小鼠初次感染乙脑病毒8d后,开始发病,出现弓背后肢瘫痪、震颤、行动迟缓、眼眶出血等症状,感染14d后,剩余的小鼠没有发生发病或死亡。GD株病毒组中,小鼠初次感染乙脑病毒7d后,开始发病,出现上述类似的症状。对照组中,没有小鼠死亡。4.2乙脑病毒株半数致死量实验的结果：NAK株病毒组中,10～105TCID5o/100μL小组小鼠死亡的数量分别为3、1、4、1、3、5，GD株病毒组中分别为0、2、4、5、1、5。由于各剂量小组小鼠死亡数量没有规律,无法计算乙脑病毒株的半数致死量。2个病毒株组中,小鼠血清中和抗体平均滴度随着病毒毒力的上升而升高。本研究选定103TCID50/100μL作为乙脑病毒感染小鼠实验的毒力浓度。4.3小鼠初次感染乙脑病毒结果：(1)小鼠血清样本中乙脑病毒检测结果：NAK病毒株组,感染后8d、10d、11d小鼠血清为乙脑病毒阳性,病毒载量为3.8×101-1.6×104 copies/mL. GD病毒株组,可在感染后4d、7d、10d、lid、14d小鼠血清检测出乙脑病毒阳性,病毒载量为0.7-9.8×102copies/mL.(2)小鼠脑组织样本中乙脑病毒检测结果：NAK病毒株组,感染后4d、7d、8d、10d、11d、14d小鼠脑组织标本中检测出乙脑病毒阳性,病毒载量为7.25×105～1.70×109copies/mL. GD病毒株组,可在感染后4d、7d、8d、10d、11d小鼠脑组织标本中检测出乙脑病毒阳性,病毒载量为6.7～7.4×108copies/mL.(3)小鼠脾组织样本中乙脑病毒检测结果：NAK病毒株组,运用荧光定量在感染后4d、1ld小鼠脾脏组织中检测出乙脑病毒阳性,病毒载量为2.2～13.5copies/mL. GD病毒株组,可在感染后4d、8d、10d小鼠脾脏组织中检测出乙脑病毒阳性,病毒载量为0.3～84.9 copies/mL.(4)小鼠肝组织样本中乙脑病毒检测结果：NAK病毒株组,GD病毒株组,对照组未在小鼠肝脏样本检测出乙脑病毒。(5)小鼠血清乙脑病毒中和抗体检测结果：小鼠初次感染乙脑病毒后,NAK、GD病毒株组乙脑病毒中和抗体滴度随时间的变化呈上升的趋势,NAK病毒株组从lOd开始,血清乙脑病毒中和抗体滴度大于1：20,GD病毒株组从11d开始,中和抗体大于1：20,而对照组小鼠的中和抗体均未检出。4.4小鼠再次感染血清乙脑病毒结果(1)小鼠死亡情况观察：对照组注射乙脑病毒8d后,开始有小鼠发病死亡,症状如前,观察结束后,对照组有3只小鼠存活。NAK组、GD组未见小鼠发病死亡。(2)小鼠再次感染后血清乙脑病毒中和抗体检测：小鼠再次感染乙脑病毒后,NAK组和GD组在感染后7d抗体滴度均大于1：300,中和抗体滴度随时间的变化,呈下降的趋势。对照组感染乙脑病毒14d后,中和抗体滴度大于1：20,中和抗体滴度随时间的变化,呈下降的趋势。研究结论1、广州和厦门地区家鼠及野鼠鼠脑组织中未分离出乙脑病毒,而血清中携带较高的乙脑病毒抗体,提示曾感染乙脑病毒。本研究提示对鼠在乙脑传播中的作用值得进一步研究。2、小鼠对人源性(NAK)和蝙蝠源性(GD)乙脑病毒株均易感,并出现与乙脑病人相似的症状。小鼠感染人源性(NAK)和蝙蝠源性(GD)乙脑病毒株后,出现病毒血症,并存在中和抗体和病毒共存的时期,具备潜在的传播乙脑病毒的能力。高滴度的中和抗体对小鼠有保护作用,而低滴度中和抗体的效能尚不明确。