牙周炎是由革兰阴性菌堆积牙齿表面形成牙菌斑,引起牙周组织微循环改变,激活宿主细胞释放炎症因子,导致牙周组织破坏,形成以牙龈炎症、牙周袋形成、牙槽骨吸收为主要特征,最终导致牙齿松动和脱落的慢性感染性疾病。我国中年居民患有牙周疾病的比例高达95%。牙周炎不仅影响多个系统性疾病的发生发展,还对人心理健康产生严重的负面影响。由此可见,牙周炎的早期预防和诊治尤为重要。在当前个体化诊疗时代,尽管基因组学、转录组学、蛋白组学、多肽学和代谢组学在医学诊断、治疗领域迅速发展,但还没有可用于牙周炎诊断、预后和治疗评估的有效生物标志物。因此,标记物的探索以及药物靶点的发现将有助于完善牙周炎的临床评估和治疗。组织低氧/缺氧是一个病理特征,主要是由于细胞氧耗量与血液运输的供氧平衡被打破而导致。正常组织氧浓度一般为2.5%-9%,而伤口和感染组织部位的氧浓度通常为1%-2%。文献报道称低氧牙周炎组IL-18和HIF-1α的浓度显著升高,表明HIF-1α在牙周炎的发生发展中可能发挥了作用,但是其对人牙周膜细胞生物学行为影响的深层次机制目前尚不完全清楚明了。LncRNA是长度约为200个核苷酸的非编码RNA,其不仅通过转录干扰或诱导染色质重塑正向或负向调控编码基因的表达,同时还可以与miRNA形成海绵体抑制miRNA的功能,促进其下游基因的表达,从而参与了细胞各种生物学行为的调控。Hua Li等人利用大鼠转录组芯片检测了局部缺血缺氧导致的急性心肌梗死大鼠模型中异常表达的LncRNAs,发现168个高表达LncRNAs和155个低表达的LncRNAs。进一步的GO和信号通路分析发现,异常表达的LncRNA通过调控PI3K-AKT信号通路参与了细胞凋亡、ERS和细胞自噬等细胞过程。此外,研究发现LncRNA HOTTIP在低氧胶质瘤细胞中显著高表达,其通过与miR-101形成海绵体,促进其下游靶基因ZEB1的表达,从而加速了胶质瘤细胞在低氧环境中的转移侵袭能力。由此可见,低氧诱导的LncRNA可能通过HIF-1α在肿瘤及炎症疾病中发挥了非常重要的分子机制作用。查阅文献,目前低氧导致的人牙周膜细胞炎症反应中差异表达的LncRNAs尚无人报道。本实验体外分离hPDLC,观察低氧条件下hPDLCs的生物学行为及相关信号通路的变化,并且利用LncRNA芯片检测牙周炎牙龈组织中差异表达的LncRNA,为进一步探索牙周炎发生发展的深层分子机制及牙周炎的分子诊断以及药物个性化靶向治疗提供一定的理论基础。本实验设计共分为以下四个部分:第一部分人牙周膜细胞的分离、培养及鉴定目的:体外分离、培养hPDLCs,对细胞进行鉴定,为后续实验奠定基础。方法:组织块法体外原代分离培养hPDLCs,免疫细胞化学试验对hPDLC细胞进行波形蛋白和角蛋白染色鉴定。结果:我们在操作中分离培养了20名患者的hPDLCs细胞,过程中因细胞生长速度缓慢,老化,传代死亡以及污染等原因,最终成功分离培养了6名患者的hPDLC,成功率为30%。原代培养过程中发现年轻人的牙周膜细胞培养成功率较大龄人群高。而且hPDLC细胞在传代3次后细胞的生长速度和状态显著好转,如果最初始细胞从组织块爬出时,增加血清浓度至20%,细胞的状态也会明显更好,大大提高了原代成功率。倒置显微镜下观察hPDLC细胞形态,对数生长期的hPDLC细胞体积大,胞浆丰富,细胞呈长梭形或星型。当细胞传代至8代之后,细胞的生长速度明显减缓,细胞体积更加肥大,胞浆中开始出现很多的黑色颗粒,胰酶消化后细胞贴壁能力明显减弱,提示细胞进入老化阶段。随后,在免疫细胞化学试验对hPDLC细胞进行波形蛋白和角蛋白染色中,发现细胞波形蛋白染色为阳性,主要分布于胞浆;而角蛋白染色为阴性,提示原代培养的hPDLC细胞是来源于中胚层的间充质成纤维细胞。结论:本实验成功培养出间充质来源的hPDLCs。第二部分低氧微环境下hPDLCs生物学行为变化目的:观察低氧对hPDLCs生物学行为的影响。方法:将对数生长期的hPDLC细胞在不同氧浓度(21%,5%,1%)的细胞培养箱进行培养,利用MTT试验检测细胞增殖能力,利用倒置显微镜观察细胞形态变化,利用细胞划痕试验检测细胞迁移能力的改变。结果:hPDLC在不同氧浓度培养箱中培养14天后,倒置荧光显微镜观察结果发现细胞数量在1个显微镜视野下明显减少,排列稀疏,并且结构发生了明显改变,趋于衰老状态。划痕试验数据表明,严重缺氧能减慢hPDLCs的迁移速度。结论:低氧可抑制hPDLCs的增殖功能和迁移能力。第三部分低氧微环境下hPDLCs中HIF1α和炎症相关信号通路的表达变化目的:探索低氧改变hPDLC细胞生物学行为的分子机制。方法:利用免疫组化试验、免疫荧光试验检测hPDLC在不同氧浓度条件下HIF-1α的细胞定位以及表达;同时用免疫印迹法检测不同氧浓度条件下hPDLC中HIF-1α、IGF-1蛋白的表达;采用定量PCR的方法检测hPDLC成骨分化相关基因以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因。结果:随着氧气浓度降低,HIF表达逐渐增加,并逐渐从细胞质转移到细胞核,并且其mRNA水平和蛋白水平HIF的表达均随着氧气浓度的降低而升高。实时荧光定量PCR数据显示严重低氧环境促进了骨分化基因OPN、ALP、CEMP和CAP的表达。免疫印迹和定量PCR检测信号通路Wnt/β-catenin的关键基因AXIN2、β-catenin、c-myc的表达均提示在低氧环境中显著高表达。结论:低氧能够促进hPDLC细胞的成骨分化能力,Wnt/β-catenin信号通路在低氧诱导的hPDLC中被激活。第四部分牙周炎牙龈组织中差异表达LncRNAs的筛选目的:获得牙周炎牙龈组织中差异表达的LncRNA表达谱,为牙周炎的分子诊断以及药物个性化靶向治疗提供理论基础。方法:委托康成生物科技有限公司利用Arraystar LncRNA 3.0芯片检测收集的40例牙周炎患者和20例正常人群牙龈组织中LncRNA的表达谱。并且利用Rt-qPCR法检测缺氧诱导hPDLC中与牙周炎组织中LncRNA的表达情况以验证芯片检测结果。结果:检测发现差异表达LncRNA高达175个,其中牙周炎牙龈组织中显著上调的LncRNA有58个,显著下调的LncRNA有117个。随后通过相关生物信息学分析(如聚类热图分析,GO分析和KEGG分析),我们发现显著高表达的LncRNA基因主要在低氧诱导的细胞代谢途径中发挥重要作用,而显著低表达的LncRNA的生物学功能主要集中在细胞炎症生物学过程中。牙周炎组织中显著高表达的LncRNA-01126在hPDLC细胞中随着氧浓度的减少而逐渐增加,并与HIF1α的表达具有显著相关性。结论:低氧环境可能诱导LncRNA-01126的表达并且参与牙周炎的低氧应激反应。