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背景动脉钙化(Arterial Calcification,AC)是糖尿病(Type 2 Diabetes,TD2)、慢性肾病(Chronic Kidney Disease,CKD)和慢性炎症性疾病中普遍存在的血管病变,也是导致原发病病情恶化、死亡率增加的高危因素之一。并与TD2和尿毒症患者血管弹性受损、冠心病支架术后再狭窄等并发症密切相关,同样与心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)的发病率和死亡率高度相关。血管钙化不仅表现相应的临床症状,治疗不及时还会引发各种血管性疾病。而血管钙化性疾病则会引发钙化性主动脉瓣疾病、尿毒症以及慢性炎症等,增加CVD的危险性。因此,血管钙化的预防和治疗对于原发病的进展和预后具有重要临床意义。迄今为止,临床上针对AC仍然缺乏有效的治疗手段。过去10年的研究发现骨调节蛋白参与了血管钙化的刺激和抑制,其中维生素K(Vitamin K,VK)依赖蛋白基质Gla蛋白(Matrix Gla Protein,MGP)是体内最强的AC抑制剂之一。MGP活化后通过抑制血管壁内钙的过饱和及钙盐的沉积,抑制血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC)向成骨样细胞分化,发挥抗血管钙化的作用。而VSMC向成骨样细胞分化是AC的关键环节和细胞学基础。但是,VSMC钙化的分子机制仍有待进一步阐明。VK依赖蛋白生长抑制特异蛋白6(Growth Arrest-Specific Protein 6,Gas6)激活后能够抑制凋亡表达并促进VSMC向血管损伤部位迁移。但是在AC的抑制中Gas6的含量以及角色如何尚不得而知。因此,我们提出以下问题:①华法令(Warfarin,WFN)诱导大鼠体内动脉钙沉积含量呈高表达状态,高剂量VK2干预后能抑制甚至逆转已形成的钙化吗?②在钙化发生、发展中VSMC发生氧化应激损伤,进而向成骨样细胞分化,最终促进细胞凋亡引发钙化形成,高剂量VK2是否影响了上述生物学反应,并通过调控凋亡的发生而影响钙化形成?③钙化大鼠主动脉组织中Gas6及其下游信号通路中蛋白激酶B(Protein Kinase B,Akt)以及抗凋亡蛋白(Astiapoptotic Proteins)B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-Cell Leukemia-2,Bcl-2)的表达水平如何?VK2干预后能通过Gas6介导的Akt凋亡信号通路抑制凋亡从而抑制钙化形成吗?以上问题都需要进一步深入研究。目的(1)构建AC模型,明确WFN诱导大鼠主动脉钙化时VK2逆转钙化形成情况。(2)观察钙化大鼠主动脉组织中活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的表达、血清碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性以及VSMC凋亡表达的变化过程,分析钙化的影响以及与凋亡的相关性。(3)明确Gas6、Axl、p-Akt、Bcl-2蛋白在WFN诱导大鼠主动脉钙化时的表达变化,探讨WFN诱导大鼠主动脉钙化时VK2逆转钙化形成的机制。方法(1)选用10 W SD雄性大鼠。用含WFN(3 mg/g饲料)和VK1(1.5 mg/g饲料)的饲料饲养6 W,建立AC模型。在此基础上,给予含VK2(100μg/g饲料)的饲料继续喂养6 W干预钙化。(2)将大鼠随机分成5组:对照组(0 W、6 W、12 W)、6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组及6 W钙化+6 W VK2组,检测各组钙化形成、ROS水平、ALP活性、凋亡表达和Gas6、Axl、p-Akt、Bcl-2蛋白表达水平。(3)邻甲酚肽络合酮比色法检测大鼠主动脉钙沉积含量。Von Kossa和茜素红染色验证钙化表达。(4)冰冻组织切片检测各组大鼠主动脉组织ROS表达。(5)心脏(右心室)取血检测ALP活性。(6)采用TUNEL与DAPI免疫荧光双标法,应用激光共聚焦显微镜观察各组大鼠主动脉组织VSMC凋亡情况。(7)应用透射电子显微镜观察各组线粒体形态改变。(8)通过蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测大鼠主动脉组织Gas6、Axl、t-Akt、p-Akt及Bcl-2蛋白表达水平。结果(1)WFN干预12 W期间动脉中钙沉积含量呈线性增长(P<0.01);6 W钙化+6 W VK2组与6 W钙化组相比钙沉积含量减少39%,与12 W钙化组相比钙沉积含量减少60%;6 W钙化+6 W VK2组治疗AC(7–12 W)约44%的预成型钙盐被移除(P<0.01)。(2)6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W VK2组、6 W钙化+6 W Normal组较对照组主动脉组织ROS表达显著增加(P<0.01),6 W钙化+6 W VK2组与6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组比较主动脉组织ROS表达显著降低(P<0.01)。(3)4 W钙化组、6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组较对照组ALP活性明显增加(P<0.01),6 W钙化+6 W VK2组与4 W钙化组、6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组比较ALP活性明显降低(P<0.01)。(4)6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组较对照组细胞凋亡表达明显增加(P<0.01),6 W钙化+6 W VK2组较6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组细胞凋亡表达明显减少(P<0.01)。Pearson相关性分析凋亡表达与钙化形成具有显著相关性,相关系数R2=0.8853,(P<0.0001)。(5)透射电子显微镜观察对照组线粒体包膜完整,嵴清晰可见。各钙化组线粒体肿胀并部分溶解,线粒体嵴减少或部分消失;VK2治疗后线粒体肿胀和溶解减轻、线粒体嵴减少或消失部分减轻。(6)6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组较对照组组织Gas6、Axl、p-Akt、Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.01);6 W钙化+6 W VK2组与6 W钙化组、12 W钙化组、6 W钙化+6 W Normal组比较部分恢复了组织中Gas6、Axl、p-Akt、Bcl-2蛋白表达(P<0.01)。结论高剂量VK2对WFN诱导的大鼠主动脉钙化有逆转作用。研究显示VK2通过上调VSMC Gas6-Axl的表达,激活Akt磷酸化,促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,从而抑制WFN诱导的大鼠主动脉组织VSMC的凋亡表达和钙化形成。明确了Gas6及其下游Axl-Akt-Bcl-2抗凋亡信号通路,可显著提升VSMC的活性及迁移能力,减少凋亡表达,进而有效抑制和/或逆转AC损伤,为解决AC损伤的治疗提供理论依据。