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研究背景三氯乙烯为一种优良的有机溶剂,常用于金属表面脱脂、羊毛及织物的干洗剂以及石蜡等的萃取等。其引起的健康损害主要包括神经系统和肝肾损害,以及更为多见的职业性三氯乙烯药疹样皮炎(occupational medicamentosa-like dermatitis induced by TCE,OMLDT)。三氯乙烯药疹样皮炎严重患者可出现急性肾功能衰竭,威胁患者生命。本课题组前期研究发现TCE致敏阳性小鼠存在显著的肾小管损伤和C5a的表达,且肝脏存在C5b-9的表达。C5b-9是补体系统激活的最终产物,其发挥亚裂解效应时可激活细胞内信号通路,促进NLRP3炎症小体的组装,释放炎症因子,参与机体炎症反应。研究目的本研究的主要目的为通过建立TCE致敏小鼠模型,探讨小鼠肾小管上皮细胞C5b-9水平以及是否存在NLRP3炎性小体的激活;通过给小鼠体内注射重组大鼠sCD59-Cys,减少C5b-9在肾小管上皮细胞的沉积,检测各组小鼠肾脏损伤情况,来判断NLRP3炎性小体的激活是否由亚裂解水平的C5b-9介导。从而探讨TCE致敏小鼠免疫性肾损伤的机制。研究方法取小鼠建立TCE小鼠致敏模型,在末次激发后72h取部分小鼠用于细胞免疫组化和免疫荧光的鉴定和细胞上清液乳酸脱氢酶水平测定。另外52只小鼠随机取5只作为空白对照组,5只作为溶剂对照组,18只作为TCE处理组,24只作为TCE+sCD59-Cys处理组,参照本课题组建立TCE小鼠致敏模型。在第19天时,TCE+sCD59-Cys处理组小鼠在进行末次激发前,给每只腹腔注射溶有25μg sCD59-Cys的磷酸盐缓冲液10μl。小鼠的致敏情况均在末次激发后24小时进行评分。根据背部评分结果,将得分≥1分者判定为致敏阳性,否则判定为致敏阴性。所有小鼠于末次激发后72h摘眼球取血,并颈椎脱臼处死。血清测量肾小管中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)水平,无菌分离出小鼠双侧肾脏后,部分制成石蜡切片用于小鼠肾脏病理损伤情况检测以及免疫组化法检测小鼠肾脏C5b-9、NLRP3、IL-1β、IL-18水平,部分用于NLRP3、ASC、Caspase-1以及IL-1βWestern Blot蛋白水平检测及基因水平检测。研究结果1空白对照组、溶剂对照组小鼠致敏率为0。TCE组致敏率为38.9%;TCE+sCD59-Cys组致敏率为41.6%。2肾小管上皮细胞免疫组化及免疫荧光鉴定结果均显示提取出的细胞呈鹅卵石样,已基本爬满整个视野。细胞表面CK18蛋白大量表达于几乎所有细胞。3根据细胞毒性或死亡率计算公式,细胞乳酸脱氢酶释放率小于5%,处于亚裂解水平。4小鼠肾脏病理结果显示TCE致敏阳性组肾脏间质可见炎细胞浸润,部分肾小管上皮细胞空泡样改变,极少量上皮细胞胞质溶解消失。TCE+sCD59-Cys致敏阳性组偶可见呈空泡样变的肾小管上皮细胞,肾脏损伤明显减轻。小鼠肾脏肾损伤分子KIM-1免疫组化结果显示TCE致敏阳性组可见大量KIM-1表达于肾小管,而TCE+sCD59-Cys致敏阳性组KIM-1表达量显著减少。血清NGAL水平在TCE致敏阳性组显著升高,且TCE致敏阳性组NGAL水平高于TCE+sCD59-Cys致敏阳性组。5免疫组化法检测小鼠肾脏C5b-9膜攻击复合物表达水平,结果显示TCE致敏阳性组小鼠肾小球中未见明显C5b-9表达,肾小管上皮细胞中可见大量表达。TCE+sCD59-Cys致敏阳性组肾小管上皮细胞中也可见C5b-9,但表达量少于TCE致敏阳性组。6免疫组化法检测小鼠肾脏炎症因子NLRP3、IL-1β和IL-18表达情况,结果显示TCE致敏阳性组肾小球中未见三种炎症因子明显表达,而主要表达在肾小管上皮细胞中。TCE+sCD59-Cys致敏阳性组也可见三种炎症因子的表达,但相对于TCE致敏阳性组,表达量明显下降,且炎症因子也集中表达于肾小管,肾小球未见明显表达。7 Western Blot结果显示空白对照组、溶剂对照组、TCE致敏阴性组以及TCE+sCD59-Cys致敏阴性组的NLRP3、ASC、Caspase-1以及IL-1β蛋白表达量均很少,TCE致敏阳性组和TCE+sCD59-Cys致敏阳性组均有NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β以及IL-18蛋白表达,但TCE+sCD59-Cys致敏阳性组表达量明显低于TCE致敏阳性组。8肾脏PCR结果显示与溶剂对照组相比,TCE致敏阳性组NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18的基因表达水平均明显升高。且TCE致敏阳性组的基因表达量显著高于相应TCE致敏阴性组和TCE+sCD59-Cys致敏阳性组基因水平。与溶剂对照组相比,TCE+sCD59-Cys致敏阳性组小鼠的IL-1β表达水平未见升高,差异无统计学意义。与TCE+sCD59-Cys致敏阴性组相比,TCE+sCD59-Cys致敏阳性组小鼠的NLRP3、IL-1β表达水平未见明显升高,差异无统计学意义。结论1 TCE致敏阳性小鼠肾小管上皮细胞存在MAC的亚裂解效应,且MAC亚裂解激活了NLRP3炎性小体,IL-1β、IL-18等炎症因子上调,肾小管上皮细胞损伤明显。2给小鼠注射sCD59-Cys重组蛋白后,小鼠肾小管上皮细胞损伤减轻。提示TCE致敏小鼠肾小管上皮细胞CD59a表达量减少或缺乏导致其对MAC抑制作用减弱,MAC的大量沉积发挥其亚裂解效应激活NLRP3炎性小体,上调IL-1β、IL-18等炎症因子水平,介导TCE致敏小鼠免疫性肾损伤。3人为注射CD59蛋白后,并不能完全控制肾小管上皮细胞的损伤,提示肾小管上皮细胞的损伤还存在其他作用机制,有待进一步研究。