研究背景结直肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,近年来,中国的结直肠癌发病率呈明显上升趋势。结直肠癌由于发现晚,复发率高,导致患者死亡率也较高,其5年生存率高度依赖于确诊时的肿瘤分期。结直肠癌的早期发现对于患者提高临床疗效及延长生存期至关重要。同时,淋巴结转移亦是影响患者预后和生存的重要因素,结直肠癌术前淋巴结状态的精准预测则是制定合理治疗方案的关键。然而,目前临床应用的影像学、实验室检查、肠镜等传统检测方法通常具有敏感性和特异性低,或花费高、有创、给患者带来不适等缺点。因此,临床亟需发展敏感、特异、经济、无创的方法,以方便结直肠癌的筛查,提高疾病诊断效率和术前淋巴结转移预测效能。此外,作为预测结直肠癌患者生存期最常用方法的TNM分期系统也存在不足,即便是同一分期的病人也存在高度复杂的异质性,其对于临床预后提供的信息非常有限。挖掘新型标志物,用于建立优于TNM分期系统的结直肠癌预后评估方法,将有助于为患者制定合理的个体化治疗方案,因而具有重要临床价值。近年来基于转录组分析的相关研究表明,非编码小RNAs(sncRNAs)具有充当肿瘤标志物的潜能。piRNAs,即与Piwi蛋白相互作用的小RNA分子,是数量最多的一类sncRNAs,最早在生殖细胞中发现其表达并具有稳定基因组的重要功能。近期研究表明,piRNAs在多种肿瘤(包括结直肠癌)中异常表达并参与肿瘤发生发展。另有研究发现,循环piRNAs在健康人外周血中稳定存在并易于检测,提示其具有充当无创检测标志物的潜能,但其在肿瘤患者中的临床价值大部分尚未明确。另一类非编码小RNA分子-microRNAs(miRNAs),是目前研究最多最透彻的sncRNAs,能够在转录后水平调节基因表达,涉及包括转移在内的多种肿瘤恶性生物学行为。近期研究发现,某些差异表达的循环miRNAs分子可作为肿瘤转移的预测因子。然而,很少有基于循环miRNAs差异表达谱的系统筛查对肿瘤患者术前淋巴结状态进行预测的研究报道。此外,乏氧是大多数实体肿瘤中预后差的患者肿瘤微环境的重要病理特征之一,而乏氧调节的miRNAs在人类肿瘤中行使重要功能,并与患者不良预后密切相关。然而,迄今为止,尚未见基于乏氧调节的miRNAs表达谱分析进行结直肠癌预后研究的报道。在本课题研究中,我们分别系统地筛选了结直肠癌特异的血清piRNAs标志物及淋巴结转移特异的血清miRNAs标志物,继而构建了用于无创性检测的结直肠癌piRNAs panel诊断模型,及基于miRNAs差异表达谱和CT扫描检查的淋巴结转移Nomogram(列线图)预测模型。此外,我们鉴定了与乏氧及生存相关的miRNAs,基于此,进一步构建了结直肠癌的预后评估模型。本研究旨在为结直肠癌的无创诊断、术前淋巴结转移预测及预后评估提供新型标志物和新思路,对于推进精准医疗时代结直肠癌的个体化治疗发展具有重要科学研究价值和临床意义。第一部分结直肠癌血清P i RNAs标志物的鉴定及其诊断模型的构建目的:piRNAs是一类新型非编码小RNAs,与肿瘤发生发展密切相关,但其血清学价值尚不明确。本研究旨在通过系统筛选和验证结直肠癌特异的血清piRNAs标志物及构建无创性诊断模型,辅助结直肠癌的临床诊断。方法:1.在初筛阶段,采用Illumina高通量测序系统对10例TNM I-II期结直肠癌血清(CRC Group A)、10例TNM Ⅲ-Ⅳ期结直肠癌血清(CRC Group B)和 10例健康对照者血清分别进行测序,检测三组血清piRNAs的表达水平并初步确定结直肠癌特异的血清piRNAs,作为候选piRNAs诊断标志物。2.在训练阶段,选取120例结直肠癌患者和120例健康对照者血清,采用实时定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR,RT-qPCR)技术对第一阶段筛选出的候选piRNAs分子进行逐一检测,确定结直肠癌组和对照组间差异具有统计学意义的piRNAs分子并纳入Logistic回归模型,建立结直肠癌特异的血清piRNA panel,采用受试者工作曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析其在结直肠癌中的诊断价值。3.在验证阶段,采用RT-qPCR技术在另一组独立样本中(验证集,包括100例结直肠癌患者和100例健康对照者)再次验证差异表达的piRNAs分子,运用ROC曲线评价血清piRNA panel对结直肠癌的诊断效能。4.与传统肿瘤标志物CEA和CA19-9进行对比,分析piRNA panel对结直肠癌的诊断效能,同时绘制Fagan’s nomogram,评估其临床应用价值。5.将训练集和验证集中有完整临床记录和随访资料的1 10例结直肠癌患者纳入预后研究,采用Kaplan-Meier生存分析和Cox 比例风险回归模型分析血清piRNAs与结直肠癌患者预后之间的相关性。结果:1.通过高通量测序初步筛选出在结直肠癌患者和对照者血清中差异表达的16个piRNAs分子。2.在训练阶段,经RT-qPCR初次验证发现piR-001311、piR-004153、piR-017723、piR-017724和piR-020365在结直肠癌组和对照组中的表达存在显著差异,且变化趋势与测序结果相一致。ROC曲线分析显示,piR-001311、piR-004153、piR-017723、piR-017724和piR-020365诊断结直肠癌的受试者工作曲线下面积(area under the ROC,AUC)分别是 0.726(95%confidence interval[CI]:0.665-0.782)、0.729(95%CI:0.668-0.784)、0.756(95%CI:0.697-0.809)、0.749(95%CI:0.690-0.803)和0.786(95%CI:0.729-0.836)。3.通过logistic回归模型构建基于5个差异表达piRNAs的结直肠癌诊断模型(即piRNA-based Panel I),公式如下:Logit(P=CRC)=-1.0391+0.1621×piR-001311 +0.203 ×piR-004153+0.3711×piR-017723+0.0897×piR-017724+0.128×piR-020365。ROC曲线分析显示该模型诊断结直肠癌的AUC为0.867(95%CI:0.817-0.907)。选取最佳cutoff值-0.1085为临界值,piRNA-based Panel I诊断结直肠癌的灵敏度为78.3%,特异度为74.2%。4.经RT-qPCR在验证集样本中再次验证5个piRNAs在结直肠癌血清中的差异表达。采用-0.1085为临界值时,piRNA-based Panel I诊断结直肠癌的AUC为0.854(95%CI:0.797-0.900),灵敏度为78.0%,特异度为76.0%。5.piRNA-based Panel I与CEA和CA19-9诊断效能的比较结果显示,CEA和CA19-9诊断结直肠癌的AUC分别为0.718(95%CI:0.656-0.774)和0.571(95%CI:0.506-0.634)。将CEA和CA19-9纳入Logistic回归方程构建CEA-based Panel II诊断模型,ROC曲线分析显示,CEA-based Panel Ⅱ诊断结直肠癌的AUC为0.735(95%CI:0.675-0.790),其诊断效能显著低于piRNA-based Panel I(P<0.001)。6.Fagan’s nomogram评估piRNA-based Panel Ⅰ的临床诊断价值结果显示,假设结直肠癌测试前概率为5%,piRNA-based Panel I的阳性似然比(+LR)为3.13,阴性似然比(-LR)为0.29。如果患者piRNA-based Panel I的结果为阳性,则确实患有结直肠癌的测试后概率将上升至14.1%;反之,如果患者piRNA-based Panel I的结果为阴性,则测试后概率将降低至1.5%。7.Kaplan-Meier生存分析显示,piR-017724低表达组患者的总生存率和无进展生存率均显著低于piR-017724高表达组患者(P=0.005和P=0.002)。Cox比例风险回归模型分析显示,血清piR-017724是结直肠癌患者总生存率和无进展生存率的独立预后指标。结论:1.本研究首次证实,结直肠癌患者血清中存在肿瘤特异性piRNAs(piR-001311、piR-004153、piR-017723、piR-017724和piR-020365),提示其可作为诊断结直肠癌的潜在新型标志物。另外,血清piR-017724在结直肠癌中具有独立预后价值。2.与传统标志物相比,血清piRNAs标志物组合对结直肠癌具有较高的诊断价值,且在Fagan’s nomogram评估中具有较高的临床应用价值。3.本研究为结直肠癌的无创诊断提供了新型标志物和新方法,具有潜在临床应用价值。第二部分基于血清mi RNAs差异表达谱和CT扫描的结直肠癌术前淋巴结转移Nomogram预测模型的构建目的:结直肠癌术前淋巴结状态的精准判断是制定合理治疗方案的关键,也是临床亟待解决的难题。本研究旨在筛选淋巴结转移特异血清miRNA表达谱,进而构建可进行无创检测的结直肠癌术前淋巴结转移预测Nomogram模型。方法:1.在初筛阶段,收集“无”淋巴结转移(LN-)和“有”淋巴结转移(LN+)的结直肠癌血清样本各10例,采用Illumina高通量测序对两组样本分别进行测序,初步筛选出两组间差异表达的血清miRNAs候选分子标志物。2.选取108例LN-和110例LN+结直肠癌血清样本作为训练样本集,采用RT-qPCR技术对候选miRNAs分子标志物进行逐一检测验证,并将差异miRNAs分子在另一独立验证样本集(包括98例LN-和100例LN+结直肠癌血清样本)验证,得到结直肠癌淋巴结转移特异性miRNAs表达谱,采用ROC曲线评价其对结直肠癌术前淋巴结状态的预测价值。3.在训练集中运用Logistic回归模型建立预测淋巴结转移的miRNA panel,并采用ROC曲线检测其在训练集和验证集中预测效能。4.通过单因素和多因素Logistic回归分析检测各临床变量与淋巴结转移的相关性,确定淋巴结转移的独立危险因素,并将独立危险因素与之前建立的miRNA panel进行整合,构建Nomogram模型。通过Hosmer-Lemeshow分析来检测Nomogram模型的拟合性,采用ROC曲线、校正曲线和决策曲线(DCA,decision curve analysis)分别检测Nomogram模型的预测效能、一致性和临床应用价值。结果:1.高通量测序结果显示,LN-组和LN+组中表达量大于1个RPM的miRNAs分子分别为317和351个。根据筛选标准,表达量大于1个RPM、两组间表达有显著差异(P<0.05)且差异倍数大于等于2倍的miRNAs分子共30个。2.RT-qPCR结果显示,在训练集中,miR-122-5p、miR-146b-5p、miR-186-5p和miR-193a-5p在LN-组和LN+组结直肠癌患者血清中的表达存在显著差异,其中miR-122-5p、miR-146b-5p和miR-186-5p在LN+组的表达水平显著高于LN-组,而miR-193a-5p在LN+组的表达水平显著低于LN-组,差异均具有统计学意义。4个miRNAs分子在验证集中的表达趋势与训练集一致。ROC曲线分析显示4个miRNAs分子预测结直肠癌淋巴结转移的AUC结果,在训练集中分别为0.726(95%CI:0.662-0.784)、0.811(95%CI:0.753-0.861)、0.744(95%CI:0.681-0.800)和0.681(95%CI:0.615-0.742),在验证集中分别是0.795(95%CI:0.733-0.849)、0.796(95%CI:0.733-0.850)、0.759(95%CI:0.694-0.817)和0.722(95%CI:0.654-0.783)。3.在训练集中,根据多变量Logistic回归模型的回归系数来加权每个miRNA分子,建立基于上述4个miRNAs差异表达谱的结直肠癌淋巴结转移预测panel(即miRNA-based panel),预测公式为:Logit(P=淋巴结转移阳性)=-1.916 +miR-122-5p × 0.495 + miR-146-5p×0.869 + miR-186-59×0.899 +miR-193a-5p×(-0.377)。选取-0.63为临界值时,该模型预测淋巴结转移的AUC为0.907(95%CI:0.860-0.942),预测灵敏度为88.2%,特异度为76.4%。4.在验证集中,以-0.63为临界值,miRNA-based panel预测淋巴结转移的AUC为0.870(95%CI:0.815-0.913),灵敏度为78.0%,特异度为83.0%。miRNA-based panel对淋巴结转移的预测效能显著优于CT扫描预测的淋巴结转移状态(训练集,AUC:0.623,95%CI:0.549-0.697;验证集,AUC:0.675,95%CI:0.600-0.750);同时,miRNA-based panel对CT预测的淋巴结转移阴性患者也有一定的预测能力(训练集,AUC:0.797,95%CI:0.701-0.892;验证集,AUC:0.764,95%CI:0.660-0.868)。5.Logistic回归分析结果显示,CT扫描预测的淋巴结状态(OR:2.605,95%CI:1.272-5.335,P=0.009)和miRNA-based panel(OR:22.902,95%CI:10.819-48.478,P<0.001)均为淋巴结转移的独立危险因素。将二者进行整合构建Nomogram模型,Hosmer-Lemeshow检验显示该Nomogram模型拟合性良好(P=0.268)。校正曲线分析显示,预测校准曲线与标准曲线(45°直线)非常靠近,这说明该Nomogram模型的预测符合度较好。ROC曲线分析显示该Nomogram模型的AUC为0.913(95%CI:0.878-0.948),预测效能较高。DCA分析显示该Nomogram模型预测淋巴结转移时净获益率高于其他模型,具有较高的临床应用价值。结论:1.本研究首次系统筛选验证了结直肠癌患者血清中与淋巴结转移密切相关的4个miRNAs表达谱(miR-122-5p、miR-146b-5p、miR-186-5p和miR-193a-5p),其对于区分“有”和“无”淋巴结转移的两组结直肠癌患者具有较高的准确性。2.我们将4个miRNAs的表达谱与CT扫描预测的淋巴结状态指标进行整合,构建了淋巴结转移Nomogram预测模型,其在训练集及验证集标本中对于结直肠癌患者术前淋巴结状态均具有较高的预测效能。3.本研究所构建的淋巴结转移Nomogram预测模型,可辅助临床医生以方便、无创的方式对结直肠癌患者的术前淋巴结状态进行个体化预测,帮助临床优化治疗方案及避免不必要的淋巴结处理程序。第三部分结直肠癌乏氧m i RNAs标志物的鉴定及其预后评估模型的构建目的:乏氧是恶性肿瘤微环境中的重要特征之一,乏氧调控的miRNAs与肿瘤患者预后密切相关。本研究旨在通过筛选和鉴定与乏氧和预后相关的miRNAs分子标志物,继而构建结直肠癌的预后评估模型,并在本地样本库中进行验证和应用。方法:1.在初筛阶段,将结直肠癌细胞HT-29分别置于乏氧和常氧条件下培养48h,随后对其进行高通量测序,分析两组细胞间miRNAs的差异表达,并按照筛选标准(拷贝数大于50且在乏氧组和常氧组的表达差异大于等于1.5倍的miRNAs分子),初步筛选出乏氧相关的miRNAs。2.在训练集中,将上述乏氧相关的miRNAs全部纳入单因素Cox 比例风险回归模型,分析miRNAs表达与患者生存期的相关性,并计算出相对应的HR和P值。随后将具有最高统计学显著性的miRNAs纳入逐步多因素Cox 比例风险回归模型进行分析,并根据回归系数加权每个miRNA分子来建立预测结直肠癌患者预后的miRNA panel。采用Kaplan-Meier生存曲线和时间依赖性ROC曲线评估miRNA panel的预后价值。3.在测试集和验证集中,根据从训练集中得到的miRNA panel公式计算出患者的风险值,并根据训练集得到的最佳临界值将患者分为高风险组和低风险组,采用Kaplan-Meier曲线和ROC曲线检测该miRNA panel在测试集和验证集中的预后价值。4.将全部受试者合并为联合样本集,采用Cox 比例风险回归分析和Kaplan-Meier分层生存分析检测miRNA panel的预后独立性,同时采用时间依赖性ROC曲线比较miRNA panel与其他临床病理参数在患者预后中的预测性能。5.将多因素Cox 比例风险回归模型分析认证的独立预后危险因子和miRNA panel进行整合,构建Nomogram预后评估模型。并采用校正曲线和ROC曲线分别检测该Nomogram模型的一致性和预测效能。结果:1.通过高通量测序初步筛选出差异表达的miRNAs分子共66个,其中52个miRNAs在乏氧细胞中表达上调,将其作为乏氧miRNAs候选标志物。2.在训练集中,进行单因素Cox 比例风险回归模型分析,按P值从小到大排列,将前8个miRNAs分子(P≤0.1)纳入多因素Cox 比例风险回归模型进行逐步分析,得到结直肠癌患者预后评估的miRNA panel,公式如下:风险值Riskscore=(0.2113 × miR-210)+(0.4688 ×miR-26a)+(0.4337 × miR-197)+(-0.2266 ×miR-375)。使用X-tile软件计算出该miRNA panel预测预后的最佳临界值为1.63,据此将患者分为高风险组和低风险组,Kaplan-Meier生存分析显示高风险组患者的总生存率显著低于低风险组患者(log-rank test,P<0.001)。ROC曲线分析显示该miRNA panel的3年AUC为0.711(95%CI:0.630-0.791),5年AUC为0.737(95%CI:0.627-0.845)。3.在测试集中,Kaplan-Meier生存分析显示miRNA panel鉴定的高风险组患者的总生存率显著低于低风险患者(log-rank test,P=0.042);分别以3年和5年为截点对该miRNA panel进行时间依赖性ROC曲线分析,结果显示miRNA panel的3 年AUC为0.568(95%CI:0.500-0.635),5 年AUC为0.657(95%CI:0.518-0.797)。验证集中所得结果与其一致:Kaplan-Meier生存分析显示高风险组患者的总生存率显著低于低风险患者(log-rank test,P<0.001);ROC曲线分析显示该miRNA panel的3 年AUC为0.688(95%CI:0.598-0.778),5年AUC为0.686(95%CI:0.539-0.833)。4.单因素和多因素Cox 比例风险回归模型分析结果显示,患者年龄(HR=3.204;95%CI:1.910-5.374;P<0.001)、术前CEA水平(HR=2.166;95%CI:1.392-3.371;P=0.001)、TNM分期(HR=1.944;95%CI:1.233-3.065;P=0.004)和miRNApanel(HR=2.806;95%CI:1.724-4.566;P<0.001)均为结直肠癌患者独立的预后因素。根据患者年龄、术前CEA水平、TNM分期对全部结直肠癌患者进行Kaplan-Meier分层生存分析,结果显示年长组、CEA正常组和CEA异常组、早期组(TNM I期+11期)和晚期组(TNM Ⅲ期+Ⅳ期)中,高风险组患者的总生存率显著低于低风险患者(log-rank test,P<0.05);年轻组高风险患者的总生存率低于低风险患者,但差异仅具有边缘显著性(log-rank test,P=0.088)。5.以3年和5年为截点进行时间依赖性ROC曲线分析,结果显示以3年为截点时,miRNA panel的AUC(0.667)显著大于TNM分期(0.616)、年龄(0.579)、CEA(0.624)和单个miRNA分子(miR-375:0.542,miR-197:0.617,miR-26a:0.550,miR-210:0.579)的AUC(P<0.05)。同样的,以5年为截点时,miRNAs panel的AUC(0.704)显著大于TNM分期(0.614)、年龄(0.608)、CEA(0.635)和单个miRNA分子(miR-375:0.588,miR-197:0.616,miR-26a:0.558,miR-210:0.569)的AUC(P<0.05)。这说明miRNA panel对结直肠癌患者的预测预后能力显著优于任何其他临床变量和单个miRNA分子。6.根据多因素Cox回归分析结果,将独立预后危险因素(包括患者年龄、术前CEA水平、TNM分期和miRNA panel)纳入Nomogram预后评估模型。校正曲线显示,该Nomogram模型的3年与5年预测校准曲线均与标准曲线(45°直线)非常靠近,这说明该模型的预测准确性较好。ROC曲线分析结果显示,该Nomogram模型的3年AUC为0.763(95%CI:0.704-0.822),5年AUC为0.752(95%CI:0.678-0.827),这提示该模型具有较高的预测效能。结论:1.本研究首次通过乏氧细胞测序和TCGA数据库筛选到4个与结直肠癌患者预后情况显著相关的乏氧诱导miRNAs分子,并根据多因素Cox模型构建了可以有效预测结直肠癌患者生存情况的miRNA panel。2.该miRNA panel是结直肠癌患者的独立预后因素,其预测效能独立于其他临床预后变量(包括TNM分期、性别和术前CEA水平),并且在一定程度上优于这些临床变量。3.我们将miRNA panel和其他临床预后变量进行整合构建了Nomogram预后评估模型,该模型可以指导临床医生更加精确便捷可视化地预测结直肠癌患者的预后情况,并指导临床个体化治疗方案的选择。