研究背景和目的诺如病毒（Norovirus, NoV）是引起非细菌性胃肠炎最主要的病原体。NoV呈高传染性,主要通过粪-口途径传播,也可以通过摄入被病毒污染的水和食物进行传播。典型的临床症状表现为NoV感染后24～48小时内出现呕吐和／或伴有腹泻,之后症状缓解,疾病呈自限性。NoV是引起5岁以下儿童胃肠炎的主要病毒性病原体,仅次于轮状病毒（Rotavirus, RV）。然而,随着轮状病毒疫苗的研制成功并在许多国家中的推广应用,使得NoV迅速取代RV成为主要的病毒性病原体。大量的肠道病毒流行病学监测数据表明,成人中的NoV感染率呈逐年上升的趋势,在老年人和免疫缺陷的人群中,NoV还会引起慢性感染、严重疾病甚至死亡。无论在发达国家还是发展中国家NoV都可以引起全年龄组人群的疾病暴发。预防和控制NoV暴发流行已成为全世界共同面临的公共卫生问题。NoV为单股正链RNA,无包膜。病毒RNA编码3个开放阅读框（OpenReading Frame, ORF）, ORF1、ORF2、ORF3,其中ORF2编码主要结构蛋白VP1, VP1由两部分组成即S区和向外凸起的P区域,并通过一段铰链区连接在一起。P区域又分为P1亚区和P2亚区,P2亚区为氨基酸高变区,根据基因突变和X射线晶体结构分析,P2亚区被认为是人类组织血型抗原（Human histo-blood group antigen,HBGA）的受体结合区域。由于NoV既不能在细胞中培养,又没有合适的小动物模型,所以有关病原体感染和进化机制的研究受到限制,阻碍了预防控制感染和疾病治疗的进展。随着基因工程技术的发展,为深入探究NoV的致病机制提供了契机。目前NoV的VPI已通过重组的杆状病毒在昆虫细胞中得到表达,并于体外自行组装成不含RNA的病毒样颗粒（virus-like particle, VLP）,由于VLP在结构和抗原性方面与天然NoV相似,具有免疫原性和受体结合特性,所以可将其作为研究NoV的替代品。近年来研究者利用大肠杆菌表达系统在体外表达NoV P区域形成P颗粒（P Particle）,其免疫原性、HBGA受体的结合能力及亲和力与VLP相似,因其具备表达周期短,稳定性高、操作简单等特点,是研究NoV的替代工具,利用P颗粒可以探究NoV与HBGA受体的结合模式,明确高危易感人群,为研制高效疫苗提供物质基础。NoV具有基因多样性,根据VP1区核苷酸序列分析,分为6个基因组（Genotypegroup,G）,即GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ、GⅥ主要感染人类的基因组为GⅠ、GⅡ,分别进一步分为9个和22个基因型。其中GⅡ.4 NoV为优势株,引起绝大多数NoV胃肠炎暴发流行。GⅡ.4 NoV易变异,每2-4年便会出现新的变异株。近期新现的变异株GⅡ.4 Sydney株于2012年澳大利亚检出,替代GⅡ.4 New Orleans株成为全球流行的优势株,并迅速席卷全球,在美国、英国、荷兰、日本、澳大利亚、法国及新西兰等国家引起不同程度的急性胃肠炎感染疫情,在我国北京、上海、广州、江苏、湖州、荆州、香港、和台湾等地均有Sydney株感染疫情的报道。本研究拟利用大肠杆菌BL21（DE3）表达系统制备GⅡ.4 NoⅤ Sydney株P颗粒,以期通过与唾液中HBGA受体的结合实验,探索我国GⅡ.4 NoⅤ Sydney株的NoV-HBGA受体结合模式,从而为明确Sydney株感染的宿主范围和制定高危人群预防策略提供基础依据。拟对广东汕尾地区体检人群GⅡ.4 NoV Sydney株的血清抗体开展调查,了解该人群Sydney株的流行状况,为NoV的预防控制提供科学信息。采用多种GⅡ.4 NoV变异株联合免疫的方式,制备具有广谱抗GⅡ.4 NoV特性的单克隆抗体,为NoⅤP颗粒亚基疫苗的研发提供实验基础。研究方法1.P区域目的片段的提取从NoV暴发现场获得粪便样本SH 2012—05,提取病毒RNA,利用PCR技术扩增P区域,测序进行核苷酸序列比对和生成系统进化树。2.pGEX-4T-1-P重组表达质粒的构建及鉴定将P区域片段连接到表达载体pGEX-4T-1上,连接产物转化至TOP 10感受态细菌,提取重组表达质粒pGEX-4T-1-P进行菌落PCR和BamHI、NoTI酶切鉴定。3.P颗粒的表达、纯化及鉴定重组表达质粒pGEX-4T-1-P转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细菌,经IPTG诱导表达可溶性重组蛋白GST-P particle。利用GST层析柱重力作用对GST-P particle进行纯化,通过凝血酶除去GST标签蛋白。表达产物进行10%SDS-PAGE电泳和Westernblot分析鉴定。4.P颗粒与HBGA受体的结合实验应用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测P颗粒与39份HBGA表型已明确的唾液样本的结合反应,在450nm波长处读取OD值,根据阴性对照OD值的分布情况,OD450≥0.12判定为阳性。5.广东汕尾地区体检人群GⅡ.4 NoV Sydney株血清抗体的检测以GⅡ.4 NoV Sydney株P颗粒为包被抗原,用间接ELISA法检测调查人群血清中的GⅡ.4 NoV Sydney株抗体。酶标仪450nm波长处读取OD值,OD450值≥0.15判断为阳性。6.GⅡ.4型NoV广谱单克隆抗体的制备采用多株GII.4型NoV P颗粒联合免疫BALB/c小鼠,按照常规杂交瘤技术进行细胞融合。间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,通过三次亚克隆得到稳定的单克隆抗体细胞系。分别利用单克隆抗体亚类试剂盒、间接ELISA法和NoV-HBGA结合阻断实验鉴定单克隆抗体的亚类、特异性和中和能力。研究结果1. GⅡ.4 NoV Sydney株P区域的获取样本SH 2012₀5经PCR扩增得到大小为1000bp的P区域片段,测序结果显示该片段与GⅡ.4 NoV Sydney/2012（登陆号：KC175323）P区域同源,同源性达到99.9%。2. pGEX-4T-1-P重组表达质粒的鉴定结果重组表达质粒pGEX-4T-1-P的菌落PCR显示大小为1000bp的条带；酶切结果显示大小为4.9kb和1000bp的两条片段,结果与预期相符,重组表达质粒pGEX-4T-1-P构建成功。3. GⅡ.4 NoV Sydney株P颗粒的鉴定结果10%SDS-PAGE电泳得到相对分子量为36kDa的蛋白,其大小与预计P颗粒大小相符,Western blot分析显示GⅡ.4 NoV Sydney株P颗粒具有抗原特异性。4. GⅡ.4 NoV Sydney株P颗粒与HBGA受体的结合模式GⅡ.4 NoV Sydney株P颗粒与A、B、AB和O型分泌型HBGA受体均能结合（OD450值均≥0.12）,其中与B型HBGA受体的亲和力最高：而与非分泌型HBGA受体不结合（OD450值≤0.09）。5.广东汕尾地区体检人群GⅡ.4 NoV Sydney株血清抗体的检测结果广东汕尾地区体检人群中的GⅡ.4 NoV Sydney株的血清抗体阳性率较高为88.14%（171/194）,其中男性血清抗体阳性率为86.11%（62/72）,女性为81.15%（99/122）。用X2检验比较不同表型HBGA受体之间性别分布,差异具有统计学意义（x2=14.041,P=0.003<0.05）。男性调查人群中不同表型HBGA受体间GⅡ.4 NoV Sydney株血清抗体阳性率差异具有统计学意义（Fisher精确检验值为9.289,P=0.013<0.05）,分泌型HBGA受体中A型和B型的抗体阳性率最高,分别是95.00%（19/20）和95.83%（23/24）；其次是O型分泌型HBGA受体,抗体阳性率为78.95%（15/19）；非分泌型抗体阳性率最低,为55.56%（5/9）。女性调查人群中不同表型HBGA受体间GⅡ.4 NoV Sydney株血清抗体阳性率差异具有统计学意义（Fisher精确检验值为11.709,P=0.007<0.05）,分泌型HBGA受体中B型抗体阳性率最高,为100.00%（19/19）；其次是A型和O型分泌型HBGA受体,抗体阳性率分别是为83.33%（20/24）和81.97%（50/61）；非分泌型抗体阳性率最低,为55.56%（10/18）。6.GⅡ.4型NoV广谱单克隆抗体的鉴定镜下观察圆形透亮的细胞呈串状分布,即为融合的杂交瘤细胞,融合率为33.07%（127/384）,融合细胞阳性率为28.35%（36/127）。共获得13株单克隆抗体,经鉴定抗体亚类均属于IgG1型,所有单抗都均能与不同GⅡ.4型NoV变异株特异性结合,其中3株单抗G7C, G2E, G4D具有明显的受体阻断能力。研究结论1.成功制备了具有良好抗原特异性的GⅡ.4 NoV Sydney株P颗粒,GⅡ.4 NoV Sydney株P颗粒能与A、B、O、AB型分泌型HBGA受体结合,而与非分泌型HBGA受体不结合。2.广东汕尾地区体检人群中的存在较高的GⅡ.4 NoV Sydney株血清抗体阳性率,分泌型HBGA受体血清抗体阳性率高于非分泌型,提示G Ⅱ.4 NoV Sydney株在该调查人群中广泛流行,分泌型HBGA受体人群较非分泌型人群更易感GⅡ.4 NoVSydney株。3.成功制备出对GⅡ.4型NoV具有广谱性的单克隆抗体,具备阻断NoV与受体结合的能力。