目的:组织工程化牙齿的研究无疑是近年来口腔医学重要的研究热点之一,但目前牙齿发生发育过程中的众多生物学机制尚不清楚,仍无法获得真正意义上的牙齿再生。而模拟牙发育的外胚间充质-上皮细胞重聚技术为牙齿组织工程带来了新的希望。来源于颅神经嵴的外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cell,EMSCs)作为一种牙源性的干细胞,是细胞重聚技术获得牙再生的理想细胞之一,被认为是除牙釉质以外牙齿各组织发育的重要来源细胞。p75NTR(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)是一种低亲和性神经营养素受体,被认为是鉴定来源于神经嵴EMSCs的主要膜受体之一,很可能参与牙齿形成,有研究发现非牙源性细胞中p75NTR可能参与促进矿化,且与矿化因子RUNX2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)有一定联系。牙源性细胞的矿化可能不同于其他细胞,牙源性细胞中p75NTR是否参与矿化以及与RUNX2的关系报道较少。因此本实验通过观察p75NTR及RUNX2在SD大鼠下颌第一磨牙成牙发育初期不同发育阶段的表达分布情况及矿化诱导后二者的变化,探讨两者在牙齿发育初期的作用及二者与矿化的联系。有助于揭示牙齿发生发育机制,推动牙齿组织工程学发展,选出适合的种子细胞。方法:1.HE染色观察下颌磨牙发育初期大鼠牙胚的形态2%戊巴比妥钠(40mg/kg)注射受孕E13.5d、E14.5d、E15.5d、E16.5d、E18.5d、P0.5d SD大鼠腹腔,等待5min左右,取出胚胎,4%多聚甲醛固定1d,取下颌组织包埋,按冠状面方向切片,厚℃为6μm,苏木素染色5 min,反蓝后伊红染色1 min,梯度酒精脱水(70%、80%、90%、100%Ⅰ、100%Ⅱ);二甲苯(Ⅰ、Ⅱ);中性树胶封片显微镜观察、拍照。2.P75NTR在大鼠胚胎下颌磨牙发育初期牙胚的时空表达取上述E13.5d、E14.5d、E15.5d、E16.5d、E18.5d、P0.5d含有SD大鼠下颌第一磨牙牙胚的冰冻切片复温30 min,PBS冲洗;滴加试剂A(5%山羊血清)封闭1h;倾去血清,滴加一抗工作液比例(p75NTR1:1500),放入湿盒,4℃过夜;倾去一抗,PBS冲洗;滴加试剂B(二抗工作液)室温30min;PBS冲洗;滴加试剂C(辣根酶标记链霉卵白素工作液)室温30min;PBS冲洗;滴入配好的DAB显色剂(A:B=50:1000)出现明显阳性流水终止反应;苏木素复染1min;1%盐酸酒精10s;蒸馏水冲洗5min;梯度酒精脱水(70%、80%、90%、100%Ⅰ、100%Ⅱ);二甲苯(Ⅰ、Ⅱ);中性树胶封片显微镜观察、拍照。3.RUNX2在大鼠胚胎下颌磨牙发育初期牙胚的时空表达取上述E13.5d、E14.5d、E15.5d、E16.5d、E18.5d、P0.5d含有SD大鼠下颌第一磨牙牙胚的冰冻切片复温30 min,后放入丙酮10min;PBS冲洗;滴加试剂A(5%山羊血清)封闭1h;倾去血清,滴加一抗工作液比例(p75NTR 1:1500),放入湿盒,4℃过夜;倾去一抗,PBS冲洗;滴加试剂B(二抗工作液)室温30min;PBS冲洗;滴加试剂C(辣根酶标记链霉卵白素工作液)室温30min;PBS冲洗;滴入配好的DAB显色剂(A:B=50:1000)出现明显阳性流水终止反应;苏木素复染1min;1%盐酸酒精10s;蒸馏水冲洗5min;梯度酒精脱水(70%、80%、90%、100%Ⅰ、100%Ⅱ);二甲苯(Ⅰ、Ⅱ);中性树胶封片显微镜观察、拍照。4.P0.5d EMSCs的获取及矿化诱导4.1 P0.5d颌突外胚间充质干细胞获得、体外培养及鉴定2%戊巴比妥钠(40mg/kg)注射受孕P0.5d SD大鼠腹腔,等待5左右,无菌条件下取出胎鼠,切取下颌突,寻找下颌第一磨牙牙胚,胰酶消化、离心,经不锈钢筛网过滤后分别加入含100ml/L胎牛血清的培养基,置于5%CO2 37℃孵育箱中培养。流式细胞技术检测细胞表面抗原对P0.5d SD大鼠EMSCs进行生物学鉴定。4.2 P0.5d EMSCs体外矿化诱导及分析利用矿化诱导液(以50 g/L抗坏血酸、10 mmol/Lβ甘油磷酸钠、10-8M地塞米松及100ml/L胎牛血清配制α-MEM矿化诱导液)每3天换液1次。矿化诱导第0d、7d、14d、21d收集蛋白进行western blot检测相关蛋白趋势。统计学方法:对本实验样本的灰℃值数据进行统计分析,采用均数(标准差)进行统计描述,各结果不同时间点的比较采用单组重复测量方差分析,并采用LSD方法进行两两比较,各指标的相关性分析采用Pearson相关分析方法。所有统计分析在SPSS 22.0软件中完成,检验水准α=0.05,双侧检验。结果:1.E13.5d大鼠的磨牙牙胚处于蕾状期,镜下可见牙板末端膨大,上皮增生,上皮的下方,周围外胚间叶细胞增生、聚集。E14.5d大鼠磨牙胚的上皮芽继续向外胚间充质生长,体积变大,基底向内凹陷,为帽状初期。E15.5d牙胚继续发育进入为帽状末期,成釉器分成3层—外釉上皮层、内釉上皮层和星网状层。周围的外胚间充质细胞密度增大,形成为细胞凝聚区,为牙乳头。包围牙乳头边缘和成釉器的外胚间充质细胞聚集形成结缔组织层,为牙囊。E16.5d进入钟状早期。E18.5d为钟状期,成釉器逐渐成熟,逐渐分化为4层—外釉上皮层、内釉上皮层、星网状层和中间层。P0.5d(钟状晚期)时,牙乳头附近的内釉上皮细胞分化为前成釉细胞,一些基底膜相邻的牙乳头细胞也开始分化成为前成牙本质细胞,而另一些分化为具有分泌功能的成牙本质细胞。在牙乳头的尖端,一部分成牙本质细胞分泌为前期牙本质基质。2.E13.5d大鼠磨牙胚处于蕾状期,p75NTR在上皮近舌侧靠近成釉器的间质高表达,此时成釉器及其下面的间质无表达。E14.5d帽状初期p75NTR染色沿着上皮爬升到牙乳头处,此时内釉上皮(釉结)出现高表达。E15.5d帽状末期p75NTR在内釉上皮层表达为分明的两部分,为次级釉结;星网状层,次级釉结,牙乳头、牙囊高表达。E16.5d钟状早期p75NTR在内釉上皮层依旧表达在次级釉结处;下方牙乳头、牙囊高表达。E18.5d钟状期p75NTR在内釉上皮全层表达。下方牙乳头、牙囊高表达。P0.5d钟状晚期,p75NTR在前成釉细胞,前成牙本质细胞,成牙本质细胞。在牙尖乳头尖处,高表达。3.E13.5d大鼠磨牙胚处于蕾状期,RUNX2成釉器下方的间质表达,此时上皮组织内无表达。E14.5d帽状初期RUNX2成釉器下方的牙乳头间质表达,上皮组织内无表达。E15.5d帽状末期RUNX2与p75NTR表达类似在内釉上皮层中的次级釉结高表达。下方牙乳头、牙囊高表达。E16.5d钟状早期RUNX2与p75NTR表达类似的表达在内釉上皮的次级釉结处。下方牙乳头、牙囊高表达。E18.5d钟状期RUNX2与p75NTR类似表达在在内釉上皮全层表达。下方牙乳头、牙囊高表达。P0.5d钟状晚期,RUNX2在各个区域表达下降。4.(1)体外分离、培养的P0.5d EMSCs均为长梭型的成纤维样细胞,胞体丰满,细胞增殖能力强。流式细胞检测:P0.5d EMSCs的CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR、CD45表达率分别为:96.22%、95.36%、96.47%、96.12%、97.27%、0.52%,阳性表达CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR,阴性表达CD45。(2)经矿化诱导液处理7d、14d、21d后的EMSCs,p75NTR和RUNX2的表达量随着诱导时间的增加而增加。以未进行矿化诱导的EMSCs作为对照,矿化诱导第7d与对照组相比,RUNX2的表达呈显著上升(P<0.05)。矿化诱导14d和21d后,细胞中的p75NTR、RUNX2表达量都显著升高(P<0.05)。在矿化过程中p75NTR与RUNX2的表达随着诱导时间的增加而上升,p75NTR与RUNX2的表达量在不同矿化时间点的相对表达量存在成正相关关系(r=0.992,P<0.001)。结论:p75NTR和RUNX2在成牙初期不同天数表达在在上皮-间充质相互作用区域,且高度相似,具有时空特异性,可能与牙齿矿化发育相关,矿化诱导后变化趋势趋于一致等说明二者在SD大鼠成牙发育初期下颌第一磨牙的发育及矿化中都起到一定的作用,可能存在正相关关系。