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研究目的:糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitu,DM)常见的慢性并发症,在欧美等国家是导致终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的常见病因。糖尿病肾病早期的病理特征是肾小球和肾小管细胞肥大伴基底膜增厚,临床表现为高滤过和微量蛋白尿。糖尿病肾病进展导致肾小球系膜基质增加,促进肾小球硬化和肾小球间质纤维化,进而肾小球功能丧失并最终导致终末期肾病。近年来研究发现高糖可刺激氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)的增加,导致氧化应激反应增强,激活多元醇、晚期糖化终末产物,蛋白激酶C和已糖胺4大代谢通路,而这4条通路激活又导致ROS增加,形成恶性循环,损伤靶器官,因此认为氧化应激是糖尿病肾病的发病基础。同时,高糖诱导肾内肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)激活,导致氧化应激,过多ROS进一步激活RAS,RAS阻断药物在糖尿病肾病治疗中所获得的益处也充分证实RAS激活是糖尿病肾病发病机制之一。随着氧化应激和RAS激活在糖尿病肾病发病机理中的作用日益受到关注,抗氧化治疗和RAS的阻断对糖尿病肾病是否有防治作用成为近期研究的热点。褪黑素(Mel)与а-硫辛酸(LA)作为强抗氧化剂,具有清除氧自由基、提高抗氧化酶的活性等作用;中药制剂通络方剂具有活血、通络、稳定细胞内皮的功能。本课题运用血生化指标检验、形态学检查、放射免疫分析和Real-time PCR等多种实验方法从生化水平和分子生物学水平研究上述药物对氧化应激和RAS的影响,探讨其对糖尿病肾病的保护作用和机制。研究方法:1、动物模型的建立:3月龄健康雄性SD大鼠(体重约190～215 g)共60只,随机选7只作为CN组(CN组,n=7):正常对照组,剩余SD大鼠用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射,3天后测末梢血糖>16.7 mmol/L为诱导糖尿病(DM)模型成功。诱导糖尿病模型后将大鼠随机分组为7组,分别为:A组(DM组,n=9):糖尿病未治疗组,等量的2%乙醇,灌胃;B组(TL1组,n=7):糖尿病通络方剂小剂量治疗组,0.5g/ kg,灌胃;C组(TL2组,n=8):糖尿病通络方剂大剂量治疗组,1.0g/ kg,灌胃;D组(MT1组,n=7):糖尿病褪黑素小剂量治疗组,0.5mg/kg,灌胃;E组(MT2组,n=8):糖尿病褪黑素大剂量治疗组,10mg/kg,灌胃;G组(TL1+ MT1组,n=7):糖尿病通络方剂小剂量0.5g/kg +褪黑素小剂量0.5mg/kg治疗组,灌胃;F组(LA组,n=7):糖尿病а-硫辛酸治疗组100mg/kg,灌胃。褪黑素溶于2%乙醇;通络方剂为超微颗粒;а-硫辛酸为浓度300mg/12ml,均溶于等量的水;DM组和CN组用等剂量的2%乙醇灌胃。清洁级饲养,为避免糖尿病大鼠血糖过高发生酮症死亡,根据每周2次尾静脉采血测血糖皮下注射2-4U诺和灵N,自由饮水和摄食。所有组每周2次尾静脉采血测定末梢血糖,每周1次测体重。饲养过程中共死亡4只:C组、G组各一只,A组2只。2、糖尿病成模后上述药物治疗10周后处死各组大鼠,分别取动脉血4ml用EDTA抗凝,2ml用特殊抗凝(每ml血用0.3M EDTA 20ul,0.32M二巯基丙醇10ul, 8-羟基喹林硫酸盐20ul抗凝)低温离心取血浆-20℃保存;取左右肾组织分别称重并记录,左肾沿冠状面切开,取肾皮质和外髓质液氮冷冻后-80℃保存。3、用自动生化仪测定各组大鼠血糖及血脂指标,包括甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。4、计算各组大鼠肾重/体重比。5、用放射免疫分析方法测定血浆和肾组织均浆中血管紧张素I和血管紧张素II(A I、A II)水平。6、用Real-time PCR的方法测定各组大鼠AT1aR mRNA和AT2R mRNA的改变。研究的主要结果:1、与CN组相比,所有STZ诱导的DM组(A-G组)均可见体重明显下降,同时血糖明显升高(P值均<0.001)。DM大鼠这种体重下降除在E组(MT2组)有轻度逆转外(P值<0.05),其余各药物组(B、C、D、G、F组)较DM组(A组)体重无明显改变(P值均>0.05);所有DM各药物治疗组(B、C、D、E、G、F组)较DM组(A组)血糖无明显改变(P值均>0.05)。CN组与DM组之间除外TC其余血脂指标无明显差异(P值均>0.05),药物治疗对DM组血脂指标无明显影响(P值均>0.01)。2、肾重/体重比在DM组较NC组明显升高(P值均<0.001),DM各药物治疗组均较DM组有不同程度逆转(P值均<0.01),并且这种逆转在MT2组(E组)最显著。3、放射免疫分析方法检测显示DM组(A组)血浆和肾组织匀浆A I、A II水平明显高于CN组(P值均<0.05),上述指标在DM各药物治疗组(B-G组)均较DM组(A组)有不同程度逆转(P值均<0.001),并在MT2和MT1+TL1组(E组和G组)较显著。4、通过用Real-time PCR的方法测定各组大鼠AT1aR mRNA和AT2R mRNA表达量,发现大鼠AT1aR mRNA和AT2R mRNA及其AT1aR/AT2R的比值在DM组(A组)均较CN组明显上调(P值均<0.001),且AT1aR mRNA这种上调改变更显著(AT1aR mRNA和AT2R mRNA表达量分别较CN组升高约39倍和4倍)。各药物治疗除LA(F组)对DM上调的AT2R mRNA无影响(P值>0.05)外,其余各药物组较DM组AT1aR mRNA和AT2R mRNA均有不同程度减少(P值均<0.001),而这种对受体下调的作用对AT1aR mRNA更为显著。这种下调改变对AT1a RmRNA影响在MT1+TL1组(G组)最强;而对AT2R mRNA影响则在TL2组(C组)最强。各药物组AT1aR/AT2R均较DM组降低(P值均<0.01)。研究结论:1、在糖尿病肾病中,高糖激活肾脏的RAS,不依赖于循环中RAS的改变而诱导局部的血管紧张素水平升高,并通过其上调的AT1aR受体,使AT1aR与AT2R受体的失衡,从而导致肾脏功能损伤;2、通络方剂及抗氧化剂(褪黑素和а-硫辛酸)均显示糖尿病肾病的保护作用,且这种保护作用并不依赖于血糖和血脂的改变;3、中药制剂通络方剂和抗氧化剂(褪黑素和а-硫辛酸)均能对糖尿病肾脏局部激活的RAS有不同程度的抑制作用,这可能是三种药物对糖尿病肾病保护作用的机制之一;4、络病是糖尿病慢性并发症的基础,氧化应激导致糖尿病肾脏局部RAS激活是糖尿病肾病发生发展的重要病理生理机制,通络方剂、褪黑素和а-硫辛酸能有效抑制RAS激活,在糖尿病慢性并发症的防治中具有广阔的应用前景。