论文部分内容阅读
细胞色素P450(cytochrome P450或CYP450,简称P450)是一种广泛存在于细菌、真菌、植物和动物体内的氧化酶系,由数量众多、功能复杂的一类血红蛋白酶组成。在昆虫中,P450分布在昆虫的各个组织器官中,参与昆虫生长、发育、繁殖等重要的生理活动,例如昆虫体内蜕皮激素与保幼激素等内源化合物的合成降解。它们对异生物质的代谢作用导致了昆虫对杀虫剂的抗药性和对植物毒素的耐受性。P450酶通过NADPH获得电子起末端氧化的作用,由P450催化的反应不仅包括氧原子的转移,同时P450酶还具有氧化酶、还原酶、异构酶及脱氢酶的活性。分离昆虫P450基因并研究其特征是明确P450如何参与虫体内重要的代谢过程的第一步,研究在很大程度上发现了昆虫抗药性形成的机理,以及使用杀虫剂对昆虫生物学和生理学的影响。本研究针对昆虫P450基因在昆虫体内不同时期不同组织的存在着差异性,确定了在其活性较高的五龄幼虫期提取mRNA,进一步通过RT-PCR.RACE等技术克隆了甘蓝夜蛾P450CYP4M以及CYP6AB基因全长序列。CYP4McDNA序列含有1909个碱基,包括一个1572个碱基的开放阅读框,编码一个含523个氨基酸的多肽,分子量约为60.9kDa,等电点为8.65。基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号JF731346。利用Expasy molecular biology server的Scanprosite facility对推导的甘蓝夜蛾CYP4M氨基酸的结构域进行预测,蛋白序列中含有P450酶的特征结构FxxGxxxCxG(461-470)血红蛋白结合域,与其它昆虫CYP4M基因有较高的同源性。将得到的CYP4M基因利用表达载体pET21b转入受体BL21中进行原核表达,经异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,分别获得与预测蛋白大小相同的蛋白条带。CYP6AB cDNA序列含有1966个碱基,包括一个1539个碱基的开放阅读框,编码一个含512个氨基酸的多肽,分子量约为58.8kDa,等电点为8.43。获得的甘蓝夜蛾CYP6AB基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号JQ901385。使用生物学软件分析甘蓝夜蛾的cDNA序列的分子特性,蛋白序列中同样含有P450酶的特征结构FxxGxxxCxG (446-455)血红蛋白结合域。构建原核表达载体,完成甘蓝夜蛾CYP6AB基因在大肠杆菌表达系统中的表达。