论文部分内容阅读
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种以高热、出血、神经症状为主要特征的猪的急性接触性传染病,由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起,其发病率和死亡率几乎高达100%,对养猪业的影响巨大。自1921年非洲肯尼亚报道首例ASF疫情至今,全世界至今没有研制出有效的疫苗。2018年8月,ASF首次传入我国,短时间内传播到大部分省市,由于大量的猪染病死亡或被扑杀,给生猪产业造成巨大损失。因此,本实验拟利用伪狂犬病基因缺失疫苗病毒作为载体,分别构建可以表达不同ASFV主要结构蛋白的重组伪狂犬病病毒载体疫苗候选毒株,为进一步开发安全有效的ASF疫苗奠定基础。ASFV结构蛋白的选择。本实验选择的p72、p54、p30、CD2v和p EP153R都是ASFV的重要蛋白。p72蛋白位于病毒的核衣壳上,产生于病毒感染晚期,抗原性好,常被用作于血清学诊断。p54蛋白位于病毒的内膜上,参与病毒的吸附和入胞过程,对病毒早期感染具有重要作用。p30蛋白位于病毒的内膜上,产生于病毒感染早期,抗原性极佳,还参与ASFV吸附易感细胞。CD2v蛋白位于病毒的外膜上,与宿主细胞的CD2蛋白非常相似,对病毒吸附至红细胞和在宿主体内扩散具有重要作用。p EP153R蛋白是ASFV的非必需蛋白质,也称为C型亮氨酸样蛋白,参与感染细胞与红细胞的吸附。已有研究表明,针对p72、p54、p30、CD2v和p EP153R蛋白的疫苗可以诱导宿主机体产生一定的免疫应答。编码p30基因的克隆表达及多克隆抗体制备。利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒SY18的结构蛋白p30基因(E183L),并将其克隆至原核表达载体p Cold I,构建重组表达质粒p Cold I-p30。将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE试验结果表明,p30在大肠杆菌获得表达。纯化表达的p30蛋白作为抗原免疫小鼠,采取的血清经过间接免疫荧光和Western blot检测结果表明,多克隆抗体具有明显的特异性。这为后续重组病毒蛋白的表达鉴定提供基础。重组伪狂犬病病毒的构建。以本实验室构建的g E和g I双基因缺失的伪狂犬病病毒株(JS-2012-Δg E/g I)为骨架,提取病毒基因组DNA,然后构建出2个能够特异性识别并剪切JS-2012-Δg E/g I TK序列的Cas质粒p Cas9-TK1和p Cas9-TK2,同时构建出5个分别含有B646L、E183L、CP204L、EP402R和EP153R基因的转移载体p BS-p72、p BSp54、p BS-p30、p BS-CD2v和p BS-p EP153R,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组将5个基因分别插入到JS-2012-Δg E/g I中,成功拯救并纯化筛选到重组病毒r PRV-p72、r PRV-p54、r PRV-p30、r PRVCD2v和r PRV-p EP153R。通过生长曲线的绘制,发现重组病毒与亲本毒具有相似的生长特性。重组病毒外源基因表达的鉴定。将重组病毒分别感染Vero细胞后,通过间接免疫荧光和Western blot检测后,结果显示p72、p54、p30蛋白能在相对应病毒感染的细胞中得到表达。综上所述,本实验应用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建出5种表达不同ASFV蛋白的重组伪狂犬病病毒疫苗候选毒株,这为进一步研制开发非洲猪瘟疫苗或疫苗组合奠定了重要基础。