【摘 要】
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目的:通过分析复方接骨片有效化学成分,研究其促进前交叉韧带断裂重建后腱骨愈合的作用机制。方法:利用中药系统药理学（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology TCMSP）、ETCM数据库、Pub Chem数据库和SIB数据库对复方接骨片的化学活性物质及作用于人体的靶点蛋白进行检索和筛选,同时应用OMIM数据库和Gene Cards数据库预测N
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目的:通过分析复方接骨片有效化学成分,研究其促进前交叉韧带断裂重建后腱骨愈合的作用机制。方法:利用中药系统药理学（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology TCMSP）、ETCM数据库、Pub Chem数据库和SIB数据库对复方接骨片的化学活性物质及作用于人体的靶点蛋白进行检索和筛选,同时应用OMIM数据库和Gene Cards数据库预测NAFLD疾病的作用靶点,并通过Uni Prot数据库查询校正蛋白名称和对应的基因名称,采用Cytoscape软件构建活性成分-靶点网络图,通过String数据库平台构建蛋白互作网络,通过DAVID数据库得到GO（gene ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析,利用Omic Share Tool云平台进行结果可视化,并构建靶点-通路网络图。选用36只日本大耳白兔,另选10只作为肌腱供体兔,根据随机数字表法选出9只作为D-d组（假手术组）,其余27只兔均由同一术者对其施行前交叉韧带离断术,并以处理好的异体半腱肌对其行改良前交叉韧带重建术,术后待兔麻醉完全苏醒后,给予兔a、b、c三种药物灌胃,a、b、c三种药物均由第三名与本实验无关人员进行配置,以便实施双盲,同时分至A、B、C三组,以A-a组、B-b组、C-c组进行标注,分笼饲养,于灌胃后4、8、12周随机选取每组3只兔进行分批处死,采取兔静脉血进行PINP、TRACP-5b、C-RP、全血白细胞计数检测以及破骨细胞ELISA检测;取兔膝关节标本通过Micro-CT观察骨隧道扩大率,生物力学检测移植后韧带极限抗拉负荷,分装标本进行HE、Masson组织学染色,比较各组各时间点腱-骨隧道愈合情况。结果:通过筛选,最终纳入本研究的自然铜（煅制）有效成分有1个,土鳖虫有效成分有1个,地龙有效成分有1个,桑白皮有效成分有32个,骨碎补（制）有效成分15个,续断有效成分8个,桑寄生有效成分2个,当归有效成分2个,乳香有效成分8个,没药有效成分45个,白芷有效成分23个,红花有效成分22个,大黄（制）有效成分16个。ACL断裂疾病靶点177个,得到药物-疾病共同靶点基因共41个。通过PPI蛋白互作关系得到41个核心基因分别为ITNF、VEGFA、MMP9、AKT1、PTGS2、CCL2、IL1B、CASP3、TP53、MMP2、PPARG、EGF、MAPK1、CXCL8、SERPINE1、FOS、ESR1、SPP1、CCND1、MMP1、MAPK14、MMP3、HIF1A、ICAM1、CAT、HMOX1、IFNG、CTNNB1、APP、ERBB2、RUNX2、IGFBP3、NOS2、COL1A1、GJA1、SOD1、IL1A、LDLR、COL3A1、PTGS1、BCL2;GO富集分析结果包括细胞对脂多糖的应答、炎症反应、细胞外泌体、膜筏、酶结合、蛋白质结合等;KEGG富集通路包括NF-κB信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、AMPK信号通路等。验证性研究结果:复方接骨片组PINP、TRACP-5b、C-RP、全血白细胞计数的相对表达量为（72.16±0.94ng/ml、8.84±2.09ng/ml、23.47±1.56ug/ml、6.36±0.45*10^9/L）,骨肽片组（6766.78±0.56ng/ml、10.23±0.04ng/ml、23.01±3.05ug/ml、4.32±0.09*10^9/L）,安慰剂组（65.82±0.70ng/ml、13.47±0.27ng/ml、24.21±5.32ug/ml、8.15±0.77*10^9/L）,假手术组（62.99±1.46ng/ml、10.59±1.02ng/ml、25.66±3.26ug/ml、4.42±0.25*10^9/L）,各项指标相对表达量组间相比（F=160.88,p=0.000<0.01;F=0.73,p=0.546>0.05;F=2.080,p=0.134>0.05;F=16.883,p=0.000<0.01）。结论:复方接骨片可能通过调节ITNF、VEGFA、MMP9等靶点,调控AKT1信号通路起到促进ACL断裂重建后腱骨愈合的作用。
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