miR-199b-5p靶向调控DDR1在肺腺癌中的作用机制研究

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[目的]研究选择H1299肺腺癌细胞株当作实验对象,查阅文献得知miR-199b-5p在肺腺癌H1299细胞中低表达,通过转染慢病毒载体在H1299细胞株中过表达miR-199b-5p,观察miR-199b-5p对肺腺癌H1299细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭等生物学行为的影响;其次,初步讨论miR-199b-5p与DDR1的彼此作用的关系;最后,通过裸鼠成瘤实验探讨miR-199b-5p在体内对肺腺癌生长的调节作用。旨在为临床上肺腺癌的诊治提供新的生物标志物和潜在靶点。[方法]1、以miR-199b-5p为作用靶点合成过表达载体并转染肺腺癌H1299细胞,同时设立NC组作为阴性对照组。2、采用荧光定量逆转录PCR及荧光显微镜检测转染效率,筛选稳定转染细胞株。3、细胞划痕实验研究过表达miR-199b-5p对肺腺癌H1299细胞迁移能力的作用。4、Transwell实验研究过表达miR-199b-5p对肺腺癌H1299细胞迁移及侵袭能力的作用。5、CCK8实验研究过表达miR-199b-5p对肺腺癌H1299细胞增殖能力的作用。6、平板克隆形成实验探究过表达miR-199b-5p对肺腺癌H1299细胞克隆形成能力的影响。7、运用荧光素酶报告基因实验检测并验证DDR1是miR-199b-5p的直接靶基因。8、蛋白质印迹实验检测过表达miR-199b-5p对肺腺癌H1299细胞中DDR1蛋白表达水平的作用。9、通过裸鼠成瘤实验探究过表达miR-199b-5p后对肺腺癌H1299细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。[结果]1、通过qRT-PCR检测显示miR-199b-5p-OE能明显提高H1299肺腺癌细胞株中 miR-199b-5p 表达水平(P<0.05)。2、CCK8检测显示miR-199b-5p-OE转染H1299细胞后细胞增殖受到显著抑制(P<0.05)。3、克隆形成实验检测显示miR-199b-5p-OE转染H1299细胞后细胞克隆形成能力受到明显抑制(P<0.05)。4、细胞划痕、Transwell实验显示经miR-199b-5p-OE转染H1299细胞后迁移速度和侵袭能力明显下降(P<0.05)。5、荧光素酶报告基因实验表明过表达组中,DDR1 3’UTR-luc-WT的荧光素酶活性明显减少,并通过qRT-PCR验证发现过表达细胞株中DDR1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。6、Western Blotting结果显示:经miR-199b-5p-OE转染后,DDR1蛋白表达降低(P<0.05)。7、裸鼠成瘤实验结果显示:经miR-199b-5p-OE转染后,裸鼠皮下成瘤能力明显受到抑制,免疫组化检测DDR1含量明显减少(P<0.05)。[结论]1、过表达miR-199b-5p可明显抑制肺腺癌细胞株H1299的增殖和侵袭,降低其迁移速度,减弱其克隆形成能力。2、miR-199b-5p过表达组中,DDR1 3’UTR-luc-WT的荧光素酶活性明显减少,DDR1 mRNA表达水平显著降低,DDR1表达含量明显降低。3、过表达miR-199b-5p可使肺腺癌细胞株H1299裸鼠皮下成瘤能力受到明显抑制,免疫组化检测DDR1含量明显减少。4、miR-199b-5p可能通过靶向DDR1在肺腺癌中起抑癌作用,是临床上肺腺癌诊断及治疗的潜在靶点。
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