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目的:稀土元素(rare earth element,REE)包括15种镧系元素以及同族的钇和钪。其中轻稀土元素的代表镧(lanthanum,La)应用广泛,在环境介质和食品中含量较高,其化学性质十分活泼且具有较强的生物活性。随着REE在各个领域的广泛应用,其越来越多进入人类的生产、生活环境,并可通过呼吸道、皮肤以及食物链富集的方式在体内蓄积。REE引发的环境残留和累积效应,特别是对人体健康的影响已经成为一个值得关注的公共卫生问题。有流行病学调查结果显示,居住在稀土矿区儿童的智商均数、学习记忆能力、注意力和推理能力均明显低于对照区儿童,且智商得分与其居所到稀土矿区的距离及家中是否堆放稀土有关。动物实验也证实,REE可致神经行为改变、学习记忆障碍、中枢神经发育缺陷、神经元形态和结构异常。根据这些研究结果可以确定:REE是一类具有神经毒性并可影响认知功能的环境因子。星形胶质细胞(Astrocytes,AC)是神经胶质细胞的主要类型之一,数量约占脑中神经细胞的50%。AC在执行生理功能时需要消耗大量能量,这些能量主要来源于线粒体。线粒体具有调控细胞生长、有丝分裂、信号转导、细胞内钙、铁离子以及电解质稳态、活性氧(ROS)生成等功能。近年来,AC在维持与调节脑功能中的重要作用已经受到广泛关注。研究证实,动力相关蛋白1(dynammin-related protein 1,Drp1)是线粒体分裂的核心调控因子。Drp1能够敏锐的感受线粒体内钙离子的变化,当钙离子异常升高时,Drp1的S616位点发生磷酸化,从而被招募到线粒体外膜上,分裂线粒体,分裂后的线粒体膜电位不均匀,其中正常膜电位的子代线粒体在线粒体融合蛋白作用下,发生融合,回到线粒体网络中。膜电位较低(即去极化)的子代线粒体则通过线粒体自噬被特异性清除。目前已知,与损害应激诱发的线粒体自噬关系最密切的是PINK1/Parkin信号通路。PINK1是一种线粒体外膜蛋白,正常情况下,PINK1以电势依赖的方式进入线粒体内膜,并被迅速降解,表达水平很低。但当线粒体受损时,线粒体膜的去极化阻止PINK1进入线粒体内膜,致使其在线粒体外膜累积,并通过磷酸化胞质中的Parkin将其募集至线粒体上,继而介导线粒体外膜蛋白的泛素化。自噬底物p62可识别泛素化蛋白,发挥适配器作用。LC3通过与p62结合,定位于去极化的线粒体上,引导分隔膜特异性识别并包裹线粒体,进而启动线粒体自噬。本课题的目的是通过体外细胞试验的方法,深入探讨La对于AC内线粒体分裂/融合以及线粒体自噬的影响,明确Drp1和PINK1/Parkin信号通路在其中起到的关键作用,为进一步阐释La所致中枢神经系统毒作用的分子机制提供新的理论依据。研究方法:使用出生24h内的Wistar仔鼠进行AC的原代培养。采用神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定AC。采用LDH法检测细胞活力并确定LaCl3处理AC的浓度;使用0.025、0.05和0.1mmol/L LaCl3处理AC后,免疫荧光法检测线粒体膜电位、线粒体ROS、Mito Traker Green分别与Drp1、LC3B、p62的共定位情况;Real-time PCR法检测Drp1、Mfn1、Mfn2、PINK1、Parkin、p62、LC3B的mRNA水平;采用Western blot方法测定AC内Drp1、p-Drp1S616、Mfn1、Mfn2、PINK1、Parkin、p62、LC3B的蛋白表达水平;采用透射电镜法检测观察AC线粒体损伤和自噬体形成情况。采用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1进行干预后,再次检测线粒体分裂/融合与线粒体损伤和自噬相关指标。结果:1.LaCl3暴露导致AC线粒体膜电位降低,ROS生成增加,随着染毒浓度的增加,ROS水平不断升高,膜电位损伤加重。2.LaCl3使AC线粒体分裂蛋白Drp1、p-Drp1S616的mRNA转录与蛋白表达水平上调,线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2的mRNA转录与蛋白表达水平下调,并促进活化的Drp1转位至线粒体。3.LaCl3上调PINK1、Parkin、LC3B mRNA转录水平和PINK1蛋白表达水平,增加线粒体对Parkin的募集和LC3B-II/LC3B-I蛋白表达比,下调p62 mRNA转录与蛋白表达水平,并增加LC3B、降低p62与线粒体的共定位水平。4.线粒体分裂抑制剂Mdivi-1能够拮抗LaCl3的上述作用,减少ROS生成,恢复线粒体膜电位,抑制Drp1的活化与转位,下调PINK1/Parkin信号通路,降低LC3B-II/LC3B-I蛋白表达比,上调p62 mRNA转录与蛋白表达水平,并减少LC3B、增加p62与线粒体的共定位水平。5.电镜下观察AC超微结构,0.1 mmol/L LaCl3处理组AC中可见线粒体肿胀,嵴消失,出现较多双层膜结构的自噬体;使用Mdivi-1干预后自噬体的数量明显减少。结论:1.LaCl3可使子代大鼠皮质AC线粒体ROS生成增多,膜电位降低,造成线粒体损伤。2.LaCl3可上调AC Drp1、p-Drp1S616表达水平,使活化后的Drp1转位至线粒体,同时下调Mfn1、Mfn2表达水平,由此促进线粒体分裂,抑制线粒体融合。3.LaCl3可激活AC PINK1/Parkin信号通路,下调p62表达水平,增加LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白表达比例,导致AC内自噬体大量形成。4.Mdivi-1可拮抗LaCl3促进线粒体分裂、诱发过度线粒体自噬的作用,减轻线粒体损伤。