目的:呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿、老年人以及免疫缺陷者下呼吸道感染的重要病原，甚至会造成死亡。但是由于疫苗的安全性问题，至今没有安全有效的疫苗批准上市。RSV疫苗增强性免疫病理反应的发病机制是研究疫苗的关键。TLR配体作为佐剂可能通过调节疫苗诱导的免疫应答类型，从而减轻或抑制疫苗增强性免疫病理。本研究选择了PamCys3(TLR-2的配体)、poly(I∶C)(TLR-3的配体)、LPS(TLR-4的配体)、CpG(TLR-9的配体)为佐剂，与FI-RSV疫苗共同免疫野生型C57BL/6小鼠，并用FI-RSV+Al(OH)3免疫MyD88-/-C57 BL/6小鼠作为对照组之一，研究TLR配体为佐剂对呼吸道合胞病毒疫苗增强性疾病的调节作用。　　方法:　　1、在Hep-2细胞上培养RSV,测定RSV滴度。　　2、制备福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)和对照组疫苗(FI-control)。　　3、动物实验　　3.1小鼠免疫　　分别用FI-control, FI-RSV, FI-RSV+CpG2216, FI-RSV+Al(OH)3,FI-RSV+poly(I∶C)，FI-RSV+PamCys3，FI-RSV+LPS免疫野生型C57 BL/6小鼠，用FI-RSV+Al(OH)3免疫MyD88-/-小鼠（C57BL/6背景），正常对照组用PBS免疫。肌肉注射免疫2次，每次间隔2周。　　3.2体液免疫检测　　末次免疫后14天小鼠尾静脉取血，分离血清，用ELISA检测抗体IgG、IgG1、IgG2a水平。　　3.3末次免疫4周后用RSV攻击被免疫小鼠，每天称取攻毒小鼠的体重，观察体重变化。　　3.4攻毒后5天，处死小鼠，取肺组织、支气管、肺冲洗液、肺匀浆，做相应检测　　3.4.1肺组织病理切片，HE染色，观察炎症浸润情况;PAS染色，观察气道粘液分泌情况;　　3.4.2支气管、肺冲洗液　　取支气管、肺冲洗液中的细胞，瑞氏-吉姆萨染色计数炎性细胞;　　3.4.3肺匀浆上清　　用空斑形成实验滴定病毒滴度;　　3.4.4血清中和抗体测定　　用空斑减少实验测中和抗体滴度;　　3.4.5 ELISA检测肺冲洗上清中细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α、IFN-γ、 IL-1β的含量;　　3.4.6实时定量PCR检测肺组织中IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、T-bet、Gata-3、ROR-γt、 IFN-γ、 RSV-N的mRNA表达。　　结果:　　1、培养出RSV，并测定病毒滴度107.9 pfu/ml。　　2、成功制备福尔马林灭活的疫苗(FI-RSV)和对照疫苗(FI-control)。　　3、ELISA间接法检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平。　　3.1 IgG　　Control组没有IgG产生，FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+CpG组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+Pamcys3组、FI-RSV+LPS组IgG含量显著高于FI-control组(P＜0.05），FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+CpG组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+Pamcys3组、FI-RSV+LPS组IgG含量显著高于FI-RSV组(P＜0.05)，FI-RSV+LPS组产生IgG抗体水平显著高于各佐剂组（P＜0.05）。　　3.2 IgG1　　Control组、FI-RSV+Pamcys3组和FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组无IgG1产生，FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+CpG组、FI-RSV+LPS组IgG1含量显著高于FI-control组、FI-RSV组（P＜0.05），FI-control组和FI-RSV组无显著性差异(P＞0.05）。　　3.3 IgG2a　　Control组、 FI-control组、 FI-RSV+Pamcys3组和 FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组无IgG2a产生，FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+CpG组、FI-RSV+LPS组与FI-RSV组IgG2a产生水平无显著差异（P＞0.05）。　　3.4 IgG1/IgG2a　　FI-RSV+LPS组(0.83)与FI-RSV组(0.96)相比IgG1/IgG2a的比值降低，FI-RSV+CpG组(1.1)、FI-RSV+Al(OH)3组(1.24)、FI-RSV+poly(I∶C)组(1.26)与FI-RSV组(0.96)相比IgG1/IgG2a的比值升高。　　4、中和抗体　　Control组无中和抗体产生，FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+CpG组、FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Pamcys3组产生的中和抗体水平显著高于FI-control组(P＜0.05)，FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组和FI-control组无显著性差异（P＞0.05），FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+CpG组、FI-RSV+LPS组和FI-RSV+Pamcys3组之间抗体滴度差别不明显，无统计学意义(P＞0.05)。　　5、小鼠体重变化（攻毒5天后）　　与Control组相比，从第二天到第六天除FI-RSV+CpG组外其它各组均无统计学差异(P＞0.05)，FI-RSV+CpG组从第二天到第四天体重减轻显著低于Control组(P＜0.05），第五天、第六天FI-RSV+CpG组体重下降与Control组无显著性差异(P＞0.05）。　　6、细胞计数结果显示　　6.1巨噬细胞　　各免疫组巨噬细胞百分比显著低于Control组(P＜0.05），FI-RSV+Pamcys3组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+LPS组显著高于FI-RSV+CpG组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组和FI-RSV组(P＜0.05），且FI-RSV+LPS组显著高于FI-RSV+Pamcys3组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-control组(P＜0.05)。　　6.2中性粒细胞　　各免疫组中性粒细胞百分数显著高于Control组(P＜0.05)，FI-RSV+LPS组显著低于除Control组外其它各组(P＜0.05)，FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组中性粒细胞百分数显著高于其它各组(P＜0.05）。　　6.3淋巴细胞　　各免疫组淋巴细胞百分数显著高于Control组(P＜0.05），FI-RSV+LPS组显著低于FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+Pamcys3组、FI-RSV+poly(I∶C)组(P＜0.05)。　　6.4细胞总数　　各免疫组细胞总数显著高于Control组(P＜0.05），FI-RSV+CpG组细胞总数显著高于其它各组(P＜0.05)，其它各免疫组差异不显著，无统计学意义（P＞0.05）。　　7、肺组织染色Control组、FI-control组、FI-RSV组、FI-RSV+CpG组、FI-RSV+Al(OH)3组、 FI-RSV+poly(I∶C)组、 FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Al(OH)3 MyD88-/-组　　7.1 PAS染色的肺组织切片显示　　与Control组相比，各免疫组被RSV攻击后均呈现不同程度的粘液分泌，FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组、FI-RSV+Al(OH)3组的粘液分泌量较多，FI-RSV组、FI-RSV+CpG组粘液分泌量次之，FI-control组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+PamCys3组粘液分泌量较少，FI-RSV+LPS组看不到粘液分泌。　　7.2 HE染色的肺组织切片显示　　Control组小鼠肺泡壁结构完整，肺泡周围仅存在少量炎性细胞;FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV+poly(I∶C)组和FI-control组小鼠支气管周围和肺泡间质炎性细胞增多，肺泡壁轻微增厚;FI-RSV组、 FI-RSV+CpG组肺泡壁增厚，肺泡间质细胞炎性细胞较多，FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组、FI-RSV+Al(OH)3组小鼠经RSV攻击后肺部气管周围浸润大量炎症细胞，肺泡壁增厚，肺泡腔减小。FI-RSV+LPS组偶见少量炎症细胞浸润肺泡间质，肺泡壁正常，支气管周围偶见少量炎症细胞。　　8、肺匀浆滴定　　Control组未检测到病毒，FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+LPS组、FI-RSV+CpG组病毒滴度显著低于FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组、FI-control组（P＜0.05），FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组与FI-control组无显著性差异（P＞0.05）。　　9、ELISA检测肺冲洗上清中细胞因子显示　　9.1 IFN-γ　　FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+PamCys3组IFN-γ含量显著高于Control组、 FI-RSV组、 FI-RSV+Al(OH)3组、 FI-RSV+LPS组及FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组(P＜0.05)，其余各免疫组无明显差异(P＞0.05)。　　9.2 IL-4　　FI-control组、FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV+CpG组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV组IL-4含量显著高于Control组、FI-RSV+LPS组和FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组(P＜0.05）， FI-RSV+PamCys3组显著高于FI-RSV+CpG组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+Al(OH)3组(P＜0.05)，其余各组无显著差异(P＞0.05）。　　9.3 IL-10　　FI-RSV组IL-10含量显著高于Control组和其它免疫组(P＜0.05），FI-RSV+CpG组、FI-RSV+PamCys3组IL-10含量显著高于FI-RSV+LPS、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组(P＜0.05)。　　9.4 IL-13　　FI-RSV+CpG组、FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV组IL-13含量显著高于 Control组、 FI-RSV+Al(OH)3组、 FI-RSV+LPS组和FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组P＜0.05); FI-RSV+PamCys3组IL-13含量显著高于FI-control组、FI-RSV+poly(I∶C)组P＜0.05)，其余各免疫组间无明显差异(P＞0.05)。　　9.5 IL-17　　FI-RSV组IL-17含量显著高于Control组和各免疫组(P＜0.05），FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组IL-17含量显著低于FI-RSV+CpG组(p＜0.05），其它各组无显著性差异(P＞0.05)。　　9.6 TNF-α　　FI-control组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+CpG组FI-RSV+PamCys3组TNF-α含量显著高于FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组和Control组（P＜0.05），其它各组无显著性差异(P＞0.05）。　　9.7 IL-1β　　FI-RSV组IL-1β含量显著高于各免疫组与Control组（P＜0.05），FI-RSV+LPS组显著低于FI-control组、FI-RSV+CpG组、FI-RSV+PamCys3组(P＜0.05)。　　9.8 IL-6　　FI-RSV+PamCys3组IL-6含量显著高于Control组和其它免疫组(P＜0.05), FI-RSV组IL-6含量显著高于Control组、FI-RSV+LPS、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组(P＜0.05)，其余各免疫组无明显差异(P＞0.05)。　　10、RT-PCR检测细胞因子表达显示　　10.1 T-bet　　FI-RSV+CpG组T-bet表达量显著高于除FI-RSV+poly(I∶C)以外其它免疫组和Control组(P＜0.05), FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组T-bet表达量显著低于除FI-RSV+LPS组以外各免疫组和Control组(P＜0.05), FI-RSV+LPS组、Control组T-bet表达量显著低于FI-control组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+PamCys3组、 FI-RSV+poly(I∶C)组、 FI-RSV组(P＜0.05),FI-RSV+LPS组和Control组无显著差异（P＞0.05）。　　10.2 IFN-γ　　FI-RSV+Al(OH)3组IFN-γ表达显著高于FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组、FI-control组、FI-RSV+LPS组和Control组（P＜0.05），其它各组无显著性差异(P＞0.05)。　　10.3 GATA-3　　FI-RSV+Al(OH)3组GATA-3的表达量显著高于除FI-RSV组以外其余各免疫组和Control组(P＜0.05), FI-control组、FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组GATA-3的表达量显著低于除FI-RSV+CpG组以外其余各免疫组和Control组(P＜0.05），另外，FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+CpG组GATA-3的表达量显著低于FI-RSV组(P＜0.05)。　　10.4 IL-5　　FI-RSV+Al(OH)3组IL-5表达量显著高于其它各组(P＜0.05)，FI-RSV+LPS组IL-5表达量显著低于其它各组(P＞0.05），FI-RSV+CpG组、FI-RSV+poly(I∶C)组IL-5表达量显著高于除FI-RSV+Al(OH)3组以外其它各组(P＜0.05)，且FI-RSV+CpG组显著高于FI-RSV+poly(I∶C)组(P＜0.05)。　　10.5 IL-10　　FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组IL-10的表达量显著低于Control组和其它免疫组(P＜0.05），且FI-RSV+LPS组和FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组之间无显著性差异(P＜0.05), FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+PamCys3组IL-10表达量显著低于 FI-control组、FI-RSV+CpG组、FI-RSV组(P＜0.05)。　　10.6 IL-13　　FI-RSV+CpG组、FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV+poly(I∶C)组IL-13的表达量显著高于Control组和其它各免疫组（P＜0.05），FI-control组、FI-RSV+LPS组IL-13的表达量显著低于FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组(P＜0.05)。　　10.7 IL-17　　FI-RSV+LPS组IL-17的表达量显著低于除FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组以外其它组(P＜0.05)，FI-RSV+PamCys3组、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组显著低于FI-control组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV组、FI-RSV+CpG组(P＜0.05)。　　10.8 ROR-γt　　FI-RSV+LPS组、FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组ROR-γt的表达量显著低于除FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+CpG组以外其它各组(P＜0.05），FI-RSV+LPS组和FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组之间无显著性差异（P＞0.05），FI-control组、FI-RSV组、FI-RSV+Al(OH)3组显著高于FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+CpG组(P＜0.05)，FI-RSV+poly(I∶C)组与FI-RSV+CpG组之间无显著性差异(P＞0.05）。　　10.9 RSV-N　　各免疫组RSV-N的表达显著高于FI-RSV+PamCys3组和Control组(P＜0.05); FI-RSV+Al(OH)3MyD88-/-组RSV-N的表达显著高于除FI-control组以外其它各免疫组(P＜0.05），FI-RSV+CpG组、FI-RSV+poly(I∶C)组、FI-RSV+Al(OH)3组、FI-RSV+LPS组显著低于FI-RSV组、FI-control组(P＜0.05)。　　结论:　　1、TLR配体作为佐剂促使RSV特异性IgG抗体水平显著提高，但对中和抗体无影响;另外，LPS可显著提高IgG2a水平，降低IgG1/IgG2a的比值。而MyD88缺陷组未见特异性抗体产生。　　2、疫苗对免疫小鼠具有保护作用，TLR配体为佐剂对疫苗的保护性无显著影响。　　3、TLR4配体LPS作为FI-RSV的佐剂抑制了疫苗增强性疾病的发生;MyD88缺陷、TLR3配体poly(I∶C)和TLR2配体PamCys3对疫苗增强性疾病有一定的抑制作用。