脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其发生率约占全部颅内肿瘤的40%；目前尽管脑胶质细胞瘤的治疗方法在不断地改善和提高，但其治疗仍然没有显著提高，而且患者预后较差，平均生存期还不到一年。治疗困难的主要原因在于脑胶质细胞瘤的恶性生物学特性；因此，为了进一步改善脑胶质细胞瘤的治疗效果，寻找和研究在脑胶质细胞瘤的恶性进展中发挥重要作用的相关分子具有重要的科学意义和临床应用价值。NOK（Novel Oncogene with Kinase-domain）基因是2004年从人扁桃体癌中克隆的一个新的癌基因（基因登录号为Genebank AAT01226），属于受体型酪氨酸蛋白激酶家族的一员。NOK基因组全长2.79kb，位于染色体12q13.2，mRNA全长1269bp，能够编码422个氨基酸，分子量约为47.6kD的蛋白质。NOK基因广泛高表达于多种肿瘤细胞和肿瘤组织，如肺癌（A549）、乳腺癌（MDA-MB-231）、急性髓系白血病（HL-60、U937和K562）、卵巢癌（HS832、OvCar3和CaOv3）和前列腺癌（LNCaP）等；这些都预示着NOK蛋白可能对肿瘤生成有一定的调控作用。但是目前尚未有关NOK基因与脑胶质细胞瘤相关性研究的报道。NOK分子能否成为有价值的脑胶质细胞瘤治疗的新靶点需要进一步的研究证实。本课题系统地研究了NOK分子在脑胶质细胞瘤中的表达特征，揭示了NOK分子在脑胶质细胞瘤中的表达特征及其与肿瘤病理分级的关系；本研究还初步探讨了NOK分子在不同表达水平下对于脑胶质瘤细胞体外增殖、侵袭、凋亡以及裸鼠致瘤性的影响，这些都有助于揭示NOK分子在脑胶质细胞瘤恶性进展中所发挥的作用。本课题主要包括以下四方面研究：1. NOK在人脑胶质细胞瘤中的表达及意义本研究首先从mRNA和蛋白水平研究了NOK分子在83例人脑胶质细胞瘤组织、10例正常人脑组织以及3株人脑星形胶质瘤细胞系（U251、BT325和U87）中的表达。反转录聚合酶链反应（Reverse-transcription PCR，RT-PCR）和Western blot研究结果发现，NOK mRNA和蛋白在U251和U87细胞中表达水平均较高，而BT325细胞中NOK mRNA和蛋白表达较低；在10例正常人脑组织中，只有1例检测到NOK mRNA和蛋白表达，其余9例均未见NOK的表达；而NOK mRNA和蛋白在不同病理级别的神经胶质瘤中均有表达，并且其表达强度随着临床病理级别的增高，NOK的表达有增高的趋势。本研究进一步采用免疫组织化学法检测了NOK蛋白在人脑胶质细胞瘤组织和正常脑组织中的表达。结果提示：NOK蛋白阳性染色定位于胞浆和/或胞膜；在83例人脑胶质细胞瘤标本中，57例标本表达检测到NOK表达，表达阳性率为68.7%，而10例正常人脑组织中只有1例表达。在人脑胶质细胞瘤及正常人脑组织中，NOK蛋白阳性表达率存在显著差异（P<0.01）。并且，NOK蛋白表达阳性率随着临床病理级别的增高而显著升高，在I~IV级肿瘤组织间差异显著（P<0.05）；但是其与患者性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤的发生部位无关（P均>0.05）。本部分研究结果表明，NOK mRNA和蛋白在脑胶质细胞瘤组织和部分细胞系中高表达，其表达强度随着脑胶质细胞瘤病理级别的升高而增高。2. NOK慢病毒表达载体及慢病毒干涉载体转染人脑胶质瘤细胞系的研究根据NOK的cDNA全长特点，设计了PCR引物，成功的从获赠真核表达载体pcDNA3.1-NOK中获得了NOK的cDNA全长，将其克隆入Gateway系统中入门克隆载体pENTR/3C中，重组体pENTR/3C-NOK酶切、PCR和测序鉴定；然后利用重组反应（Gateway LR Clonase Reaction），将pENTR/3C-NOK重组体中的NOK全长导入慢病毒载体pLenti-6.3/V5中，重组体pLenti-6.3/V5-NOK酶切、PCR鉴定和测序；pLenti-6.3/V5-NOK和对照质粒pLenti-6.3/V5-cherry分别与辅助质粒psPAX2, pMD2.G，按照4：3：1的比例混合，分别转染293T细胞进行病毒包装。慢病毒感染BT325细胞，Blasticidin抗性筛选出稳定细胞株分别命名为BT325-NOK和BT325-cherry细胞，RT-PCR和Western blot法检测稳定细胞株中NOK mRNA和蛋白表达水平，结果显示：与BT325-cherry细胞相比，BT325-NOK细胞中的NOKmRNA和蛋白表达水平显著升高。将购买两个NOK慢病毒干涉载体（pLKO.1-NOK-1和pLKO.1-NOK-2）及对照载体scramble分别与辅助质粒psPAX2, pMD2.G，按照4：3：1的比例混合，分别转染293T细胞进行病毒包装。慢病毒感染U251细胞，嘌呤霉素抗性筛选出稳定细胞株分别命名为U251-sh1、U251-sh2和U251-control细胞，RT-PCR和Western blot法检测稳定细胞株中NOK mRNA和蛋白表达水平，结果显示：与U251-control细胞相比，U251-sh1和U251-sh2细胞中的NOK mRNA和蛋白表达水平均受到明显抑制。本部分结果提示：成功构建含有NOK全长的慢病毒表达载体，将该载体和NOK慢病毒干涉载体分别进行病毒包装，分别感染脑胶质瘤细胞系，成功的建立了上调或抑制NOK mRNA和蛋白表达的稳转细胞系，为下一步研究NOK分子在调控脑胶质瘤细胞生物学特性中的作用提供了良好的细胞模型。3.上调或抑制NOK基因的表达对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响本部分针对已经建立的两组稳转细胞系（U251-sh1、U251-sh2、U251-control和BT325-NOK、BT325-cherry）进行实验研究。首先观察了NOK基因对胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响；MTT绘制生长曲线显示：与U251-control细胞相比，U251-sh1和U251-sh2细胞生长、增殖均受到明显抑制（P<0.05）；BT325-NOK细胞的增殖明显增快，显著高于BT325-cherry细胞（P<0.01）。平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验用来测定细胞克隆形成数量，结果发现：U251-sh1和U251-sh2细胞增殖数和克隆形成数均明显低于其对照组（P<0.01）；BT325-NOK细胞增殖数和克隆形成数则显著高于其对照组（P<0.01）。流式细胞术检测细胞周期结果显示发现：与U251-control细胞相比，U251-sh1和U251-sh2两组细胞的G1期细胞均明显增加（P<0.01），G2/M期细胞均明显减少（P<0.01），发生了G1期阻滞；与对照组BT325-cherry细胞相比，BT325-NOK细胞的G0/G1期细胞明显减少（P<0.01），S期细胞显著增多（P<0.01），G2/M期细胞略有增多。其次我们运用划痕实验和Transwell侵袭小室法观察了NOK基因对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响；结果发现：U251-sh1和U251-sh2两组细胞的迁移能力均明显低于其对照组（P<0.01），而且在Transwell实验中，U251-sh1和U251-sh2两组细胞穿过Matrigel的细胞数也均明显低于其对照组（P<0.01）；与BT325-cherry细胞相比，BT325-NOK细胞的迁移和侵袭能力均明显增加（P<0.01）。本部分研究结果表明，NOK基因可能在调控人脑胶质瘤细胞的体外增殖和侵袭等恶性生物学特性中发挥重要作用。4. NOK基因RNAi对人脑胶质瘤细胞裸鼠体内成瘤、增殖以及侵袭的影响本部分研究U251-control、U251-sh1和U251-sh2三种细胞分别接种于裸鼠背部皮下，定期测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，观察其在裸鼠体内的成瘤性。共观察了30天。Western blot方法检测移植瘤组织中NOK蛋白的表达情况。实验结果发现：U251-sh1和U251-sh2两组细胞在裸鼠体内的成瘤能力和生长速度均明显低于其对照组（P<0.01），肿瘤体积和重量也均明显低于其对照组（P<0.01）；结果显示与U251-control组相比，U251-sh1和U251-sh2组的肿瘤中NOK蛋白表达均明显抑制（P<0.01），而U251-sh1和U251-sh2组之间的NOK蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）。研究结果进一步证实了下调NOK基因的表达可以抑制脑胶质瘤细胞的体内增殖和侵袭能力。综上所述，我们认为NOK分子可能在人脑胶质瘤的发生与发展中起着重要的促进作用，不仅是一个有价值的人脑胶质细胞瘤生物标记分子，同时NOK分子也可能是人脑胶质瘤基因治疗的一个潜在候选靶点。