论文部分内容阅读
近些年来，转基因技术和体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer, SCNT)相结合使得转基因动物的生产效率有了很大的提高，然而外源基因整合到受体染色体上的整合机制还不是很清楚。本研究主要利用TAIL-PCR和Junction PCR等方法对5头通过SCNT技术得到的转基因克隆牛的整合位点进行克隆，并对整合位点的特征进行了分析，以期为揭示外源基因整合到受体染色体的机制提供依据。所得结果如下: 1.应用TAIL-PCR对5头转人α-乳清蛋白基因克隆牛的外源基因的插入位点的3侧翼序列进行克隆，得到了26条3侧翼序列，并依据其特征将其分成A，B和C三种整合类型。 2.在26条3侧翼序列中存在一个共同的特征，即当外源基因整合到受体染色体上时，外源片段的3均在第15821个核苷酸处发生断裂，并且和染色体上的一段大小为200-300bp左右的未知序列相连，命名为UN1，其中227bp在不同3侧翼序列中完全一致。而在B和C类型的3侧翼序列中，发现有另一段未知序列，命名为UN2。 3.通过TAIL-PCR未能得到5侧翼序列，但是通过5特异引物PCR方法，我们分别得到了样本081223，样本172和样本189的1条5侧翼序列，与3侧翼序列结合，构成三个完整的整合位点。在外源基因整合到染色体上的相接处发现了拓扑异构酶Ⅰ的酶切位点。 4.在样本081223中，外源基因整合在牛的1号染色体的基因组克隆中。分析发现外源基因5端缺失417bp，3端缺失3875bp，并且由于外源基因的整合造成了46bp的染色体缺失，外源基因的3末端与染色体之间插入了一段262bp的UN1片段。 5.样本172中外源基因整合在牛的2号染色体的基因组克隆中，分析发现外源基因5端缺失482bp，3端同样缺失3875bp，并且由于外源基因的整合造成了76bp的染色体缺失。外源基因的3末端与染色体之间插入了一段263bp的UN1片段。 6.样本189中外源基因整合在牛的24号染色体的基因组克隆中，分析发现外源基因5端缺失290bp，3端缺失3875bp，并且由于外源基因的整合造成98bp的染色体缺失。外源基因的3，末端与染色体之间插入了一段266bp的UN1片段。 以上研究结果说明，当外源基因插入到受体基因组时，受体染色体发生了复杂的重排，导致了外源基因和受体染色体不同程度的缺失;在不同的转基因样本中，插入位点存在着一定的共同特征，以上研究结果将为探寻转基因插入位点的规律提供重要依据。